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专利号: 2005100621826
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于所述的方法如下: 取被测含酰胺酶的样品溶于pH为5~9的缓冲溶液中,添加羟胺, 使羟胺终浓度为0.5~1.0M,并添加手性的S-酰胺或R-酰胺为底 物,使手性的酰胺终浓度为5~30mM,于20~50℃水浴中进行反 应,取反应所得转化液添加含Fe3+的溶液进行显色,若显红棕色 则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型一 致或含有的酰胺酶没有光学选择性,若显淡黄色则表明被测样品 含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型相反。

2.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于对 转化液显红棕色的被测样品,进一步以所添加的手性酰胺立体构 型相反的手性酰胺为底物,重复如权利要求1所述的操作,若显 红棕色则表明被测样品含有的酰胺酶没有光学选择性,若显淡黄 色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与所添加的底物的 立体构型相反。

3.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于所 述的手性的酰胺为下列之一:①二甲基环丙甲酰胺,②叔丁基亮 氨酸酰胺,③3,3,3-三氟-2-甲基丙酰胺,④哌嗪-2-酰胺。

4.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于所 述的含酰胺酶的样品的筛选方法如下:待筛选的微生物或酶样品 溶于pH为5~9的缓冲溶液中,添加酰胺和羟胺,使酰胺终浓度 为5~30mM、羟胺终浓度为0.5~1.0M,于20~50℃水浴中进行 反应,取转化液添加含Fe3+的溶液进行显色,显红棕色则表明待 筛选样品具有酰胺酶活性,显淡黄色则表明待筛选样品不具有酰 胺酶活性。

5.如权利要求4所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于所 述的酰胺为下列之一:①脂肪族酰胺;②芳香族酰胺;③杂环族 的酰胺。

6.如权利要求5所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于所 述酰胺为下列之一:①乙酰胺;②正丁酰胺;③对羟基苯乙酰胺; ④烟酰胺。

7.如权利要求1~6之一所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征 在于所述的含Fe3+的溶液为FeCl3的盐酸溶液。

8.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于所 述的方法如下:

(1)取待筛选微生物菌体均匀分散于pH=7.0~9.0的磷酸缓冲 液中,制成OD600值为5~10的菌悬液,添加酰胺和羟胺, 使酰胺终浓度为5~30mM、羟胺终浓度为0.5~1.0M,于 30℃水浴中进行反应,取转化液添加含Fe3+的溶液进行显 色,显红棕色则为酰胺酶阳性样品,显淡黄色为酰胺酶阴性 样品;

(2)另取酰胺酶阳性样品2份,溶于缓冲液中,各添加羟胺至终 浓度为0.5~1.0M,并各自添加手性的R-酰胺和S-酰胺进行 对照,所添加手性酰胺终浓度为5~30mM,于20~50℃水 浴中进行反应,分别取转化液添加含Fe3+的溶液进行显色, 若仅有1份转化液显红棕色表示样品所含酰胺酶的光学选 择性与显红棕色样品所添加的手性酰胺的立体构型一致,2 份转化液均显红棕色则表示样品所含酰胺酶没有光学选择 性。

9.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于所 述的方法如下:

(1)取待筛选微生物菌体均匀分散于pH=7.0的磷酸缓冲液中, 制成OD600=10.0的菌悬液,添加乙酰胺和羟胺,使乙酰胺 终浓度为5~30mM、羟胺终浓度为0.5~1.0M,于30℃水 浴中进行反应,取转化液添加2倍于取样转化液体积的 FeCl3的HCl溶液进行显色,显红棕色则为酰胺酶阳性样品, 显淡黄色为酰胺酶阴性样品;

(2)另取酰胺酶阳性样品2份,溶于缓冲液中,各添加羟胺至 终浓度为0.5~1.0M,并各自添加R-(-)-2,2-二甲基环丙甲酰 胺和S-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺进行对照,所添加手性酰 胺终浓度为20mM,于30℃水浴中进行反应,分别取转化 液添加2倍于取样转化液体积的FeCl3的HCl溶液进行显 色,若仅有1份转化液显红棕色表示样品所含酰胺酶的光 学选择性与显红棕色样品所添加的酰胺的立体构型一致,2 份转化液均显红棕色则表示样品所含酰胺酶没有光学选择 性。

10.如权利要求8或9所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在 于步骤(2)中对照组间底物浓度、催化剂量及其它反应条件相同。

11.如权利要求9所述的光学选择性酰胺酶筛选方法,其特征在于步 骤(2)中对转化液进行定时取样,离心去除菌体或细胞提取物后, 测定生成的氧肟酸含量。