1.一株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的双酶共表达重组菌，其分类命名为大肠杆菌Rosetta/pETDuet-rcr-fdh(Escherichia coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 208123。

2.利用权利要求1所述的双酶共表达重组菌不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的方法，其特征是将(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶相偶联，利用培养后的重组菌株，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应：在1mL 0.1mol/L pH6.0～6.5的醋酸缓冲液，或

1mL 0.1mol/L pH 7.0～7.5的磷酸缓冲液，或1mL0.1mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入1～5mmol/L ZnCl，细胞浓度为0.1g/mL，2-羟基苯乙酮底物浓度为6g/L，反应温度30℃，反应时间48h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是重组菌株的培养

LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0；固体培养基添加

1.5％琼脂粉；

培养条件：挑取重组菌株的单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养12h；取1mL培养液转接于50mL含

100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养至OD600为0.6～0.8后，培养物中加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷至1mmol/L，30℃下诱导培养10h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是重组菌株的构建

TM

将目的基因rcr和fdh有序插入表达载体pETDuet -1中，构建重组质粒pETDuet-rcr-fdh，重组质粒转化大肠杆菌E.coli Rosetta感受态细胞，通过含有

100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板筛选目的重组菌株E.coliRosetta/pETDuet-rcr-fdh。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是重组质粒pETDuet-rcr-fdh的构建TM利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ，对密码子优化后的rcr与载体pETDuet -1分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pETDuet-rcr；利用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对扩增得到的fdh基因与载体pETDuet-rcr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有两个目的基因片断的重组质粒pETDuet-rcr-fdh。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是rcr密码子优化基因的获得

以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有Nde Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位点的引物：含Nde Ⅰ的Rcr-F1，Rcr-F2，Rcr-R1，含Xho Ⅰ的Rcr-R2：Rcr-F1：5’-ATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTACGGATTCGTATTCAATAAGCAATCAGGACTTAAGTTGCGT-3’，Rcr-F2：5’-GCATTGGTGAAATTCGTATCTTG-3’，Rcr-R1：5’-CAAGATACGAATTTCACGCAATGC-3’，Rcr-R2：5’-TGACTCTCGAGCTATGGATTAAAAACAACACGACCTTCATAAGCATTGTTACGCAA-3’，采用SOE-PCR的方法，将突变位点引入，将第61～63，829～831，838～840，970～

972，991～993的CGA或AGA均突变为CGT；步骤为：

上游cDNA片段及下游cDNA片段的获得：以近平滑假丝酵母基因组为模板，分别以引物Rcr-F1和Rcr-R1，引物Rcr-F2和Rcr-R2进行PCR反应；PCR反应体系：ddH2O 37μL，

10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL 的 引 物 Rcr-F1 和Rcr-R1、或引物Rcr-F2和Rcr-R2各1μL，基因组DNA 5μL，5U/μL Taq DNA polymerase

0.5μL；

密码子优化后基因rcr全长的获得：PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min、

52℃～62℃1min、72℃1min，进行25个循环；72℃延伸10min；

将上、下游cDNA片段经退火重叠连接，两端单链于72℃用Taq DNAPolymerase延伸10min补成双链，作下一轮PCR的模板，通过PCR反应：用Rcr-F1和Rcr-R2作引物，

94℃3min；94℃1min、55℃1min、72℃1min，30个循环；72℃延伸10min，获得密码子优化后的rcr基因，全长为1008bp。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是用于获得密码子优化后rcr基因所需要提取的基因组的菌种为近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCCM203011。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征是fdh基因的获得

以博伊丁假丝酵母基因组为模板，利用含有EcoR Ⅰ限制性酶切位点的引物Fdh-F：5’-CCACCGAATTCATGAAGATCGTTTTAGTC-3’，和含有Not Ⅰ限制性酶切位点的引物

Fdh-R：5’-TGACTGCGGCCGCTTATTTCTTATCGTGTTTAC-3’，通过PCR反应扩增fdh基因；

PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物Fdh-F和Fdh-R各1μL，基因组DNA 5μL，5U/μL的Taq DNA polymerase

0.5μL；

PCR反应过程：94℃预变性5min；94℃1min、56℃1min、72℃1min，进行30个循环；

72℃延伸10min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征是用于获得fdh基因所需要提取的基因组的菌种为博伊丁假丝酵母(C.boidinii)。