1.一株四个酶偶联的不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的重组菌,其分类命名为大肠杆菌BL21/(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb),已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M 208126。
2.权利要求1所述重组菌CCTCC NO:M 208126的构建方法,其特征是步骤为:
(1)近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组和大肠杆菌DH5α基因组的获取近平滑假丝酵母的培养基组成以g/L计:葡萄糖40,酵母膏5,(NH4)2HPO413,KH2PO4 7,ZnSO4·7H2O 0.3,NaCl 0.1,pH 7.0;将近平滑假丝酵母菌种接种于近平滑假丝酵母的培养基装液量为20%的250mL摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48h;
大肠杆菌的培养基组成以g/L计:胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,pH 7.0;将大肠杆菌菌种接种于大肠杆菌的培养基装液量为20%的250mL摇瓶中于37℃、200rpm振荡培养12h;
上述两种菌体培养结束后,分别将菌体于6,000rpm离心20min,用生理盐水洗涤两次后收集细胞,利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒GenomicDNA Extraction Miniprep System提取基因组;
(2)基因rcr的获得:以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组作为PCR反应模板,利用含有NdeI限制性酶切位点的引物RCR_F,含有XhoI限制性酶切位点的引物RCR_R,通过PCR扩增反应,获得rcr基因,其全长为1008bp;
RCR_F:5’-ATCGATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTAC-3’,
RCR_R:5’-TGACTCTCGAGTG GATTAAAAACAACTCTACCTTC-3’,
PCR反应体系:ddH2O 37μL,10×Reaction Buffer 5μL,25mmol/L的dNTP0.5μL,50pmol/μL的引物RCR_F和RCR_R各1μL,近平滑假丝酵母基因组5μL,5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL;PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃1min,57℃1min,72℃1min,进行30个循环;72℃延伸10min;获得rcr基因;
(3)基因scr的获得:以近平滑假丝酵母CCTCC M203011基因组作为PCR反应模板,利用含有EcoRI限制性酶切位点的引物SCR_F,含有NotI限制性酶切位点的引物SCR_R,通过PCR扩增反应,获得scr基因,其全长为837bp;
SCR_F:5’-ATCGAATTCGATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’,
SCR_R:5’-TGACTGCGGCCGCCTATGGACACGTGTATCCACCGTC-3’,
PCR反应体系:ddH2O 37μL,10×Reaction Buffer 5μL,25mmol/L的dNTP0.5μL,50pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1μL,近平滑假丝酵母基因组5μL,5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL;PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃1min,55℃1min,72℃1min,进行30个循环;72℃延伸10min;获得scr基因;
(4)基因pntb的获得:以大肠杆菌DH5α基因组作为PCR反应模板,利用含有EcoR V限制性酶切位点的引物PNTB_F,含有XhoI限制性酶切位点的引物PNTB_R,通过PCR扩增反应,获得pntb基因,其全长为1386bp;
PNTB_F:5’-CGCGATATCATGTCTGGAGGATTAGTTAC-3’,
PNTB_R:5’-CCCCTCGAGTTACAGAGCTTTCAGGATTG-3’,
PCR反应体系:ddH2O 37μL,10×Reaction Buffer 5μL,25mmol/L的dNTP0.5μL,50pmol/μL的引物PNTB_F和PNTB_R各1μL,大肠杆菌基因组5μL,5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL;PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃1min,58℃1min,72℃1min,进行30个循环;72℃延伸10min;获得pntb基因;
(5)基因pnta的获得:以大肠杆菌DH5α基因组作为PCR反应模板,利用含有BamHI限制性酶切位点的引物PNTA_F,含有Hind III限制性酶切位点的引物PNTA_R,通过PCR扩增反应,获得pnta基因,其全长为1530bp;
PNTA_F:5’-CGCGGATCCATGCGAATTGGCATACCAAG-3’,
PNTA_R:5’-CCCAAGCTTTTAATTTTTGCGGAACATTTTC-3’;
PCR反应体系:ddH2O 37μL,10×Reaction Buffer 5μL,25mmol/L的dNTP0.5μL,50pmol/μL的引物PNTA_F和PNTA_R各1μL,大肠杆菌基因组5μL,5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL;PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃1min,55℃1min,72℃1min,进行30个循环;72℃延伸10min;获得pnta基因;
(6)重组质粒pETDuet-rcr-scr的构建:
先利用限制性内切酶NdeI和XhoI对基因rcr和载体pETDuetTM-1分别进行双酶切处理,处理后DNA片断通过粘性末端连接,获得带有基因rcr的重组质粒pETDuet-rcr;再利用限制性内切酶EcoRI和NotI对基因scr和载体pETDuet-rcr分别进行双酶切处理,处理后DNA片断通过粘性末端连接,获得带有两个目的基因rcr和scr的重组质粒pETDuet-rcr-scr;
(7)重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb的构建:
先利用限制性内切酶EcoRV和XhoI对基因pntb和载体pACYCDuetTM-1分别进行双酶切处理,处理后DNA片断通过粘性末端连接,获得带有基因pntb的重组质粒pACYCDuet-pntb;再利用限制性内切酶BamHI和HindIII对目的基因pnta和载体pACYCDuet-pntb分别进行双酶切处理,处理后DNA片断通过粘性末端连接,获得带有两个目的基因pnta和pntb的重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb;
(8)重组质粒共转化大肠杆菌
取重组质粒pETDuet-rcr-scr和pACYCDuet-pnta-pntb各2μL,共转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)惑受态细胞,转化液涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB平板上,37℃倒置培养过夜,获得阳性克隆E.coliBL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)。
3.重组菌CCTCC NO:M 208126的诱导培养,其特征是采用LB液体培养基以g/L计:胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10,pH 7.0;
挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,于37℃、200rpm振荡培养过夜;取1mL培养液转接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,于37℃、200rpm振荡培养至OD600为0.6;加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖苷1mmol/L,30℃下诱导培养酶偶联重组菌CCTCC NO:M 208126 10h。
4.利用培养后的酶偶联重组菌CCTCC NO:M 208126不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的方法,其特征是以(R)-苯基乙二醇为底物,进行不对称转化反应:在1mL 0.1mol/L pH5.0~6.0的醋酸缓冲液,或1mL 0.1mol/L pH 6.5~7.0的磷酸缓冲液,或1mL 0.1mol/L pH 7.5~8.0的Tris-HCl缓冲液中,(R)-苯基乙二醇底物浓度为105mmol/L,5mmol/L硫酸锌,重组菌细胞浓度为0.1g/mL,30℃下反应48h,产物为(S)-苯基乙二醇。