1.一株四个酶偶联的不对称转化制备(S)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命 名为大肠杆菌BL21/(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)Escherichia coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)，已保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏编号：CCTCC NO：M 208126。

2.权利要求1所述重组菌CCTCC NO：M 208126的构建方法，其特征是 将基因rcr和scr有序插入载体pETDuetTM-1，构建重组质粒pETDuet-rcr-scr； 将基因pnta和pntb有序插入载体pACYCDuetTM-1，构建重组质粒 pACYCDuet-pnta-pntb；将质粒pETDuet-rcr-scr和pACYCDuet-pnta-pntb共转化 大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含有100μg/mL氨苄青霉素和34 μg/mL氯霉素的LB平板筛选，获得目的重组菌株E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)；

(1)近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011基因组和大肠杆菌 (E.coli DH5 α)基因组的获取近平滑假丝酵母的培养基组成以g/L计：葡萄糖40，酵母膏5，(NH4)2HPO4 13，KH2PO4 7，ZnSO4·7H2O0.3，NaCl0.1，pH 7.0；将近平滑假丝酵母菌种接 种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于30℃、150rpm振荡培养48h；

大肠杆菌的培养基组成以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10， pH7.0；将大肠杆菌菌种接种于培养基装液量为20％的250mL摇瓶中于37℃、 200rpm振荡培养12h；

上述两种菌体培养结束后，分别将菌体于6,000rpm离心20min，用生理盐 水洗涤两次后收集细胞，利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因组；

(2)基因rcr的获得：以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011 基因组作为PCR反应模板，利用含有NdeI限制性酶切位点的引物RCR_F，含 有XhoI限制性酶切位点的引物RCR_R，通过PCR扩增反应，获得rcr基因， 其全长为1008bp；

RCR_F：5’-ATCGATCGCATATGTCAATTCCATCAAGCCAGTAC-3’，

RCR_R：5’-TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTC-3’，

PCR反应体系：ddH2 O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物RCR_F和RCR_R各1μL，近平滑假丝酵母基因组5 μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min； 94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得 rcr基因；

(3)基因scr的获得：以近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)CCTCC M203011 基因组作为PCR反应模板，利用含有EcoRI限制性酶切位点的引物SCR_F，含 有NotI限制性酶切位点的引物SCR_R，通过PCR扩增反应，获得scr基因，其 全长为837bp；

SCR_F：5’-ATCGAATTCGATGGGCGAAATCGAATCTTATTG-3’，

SCR_R：5’-TGACTGCGGCCGCCTATGGACACGTGTATCCACCGTC-3’，

PCR反应体系：ddH2 O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1μL，近平滑假丝酵母基因组5 μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min； 94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得 scr基因；

(4)基因pntb的获得：以大肠杆菌(E.coli DH5 α)基因组作为PCR反 应模板，利用含有EcoRV限制性酶切位点的引物PNTB_F，含有XhoI限制性酶 切位点的引物PNTB_R，通过PCR扩增反应，获得pntb基因，其全长为1386bp；

PNTB_F：5’-CGCGATATCATGTCTGGAGGATTAGTTAC-3’，

PNTB_R：5’-CCCCTCGAGTTACAGAGCTTTCAGGATTG-3’，

PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物PNTB_F和PNTB_R各1μL，大肠杆菌基因组5μL， 5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得pntb 基因；

(5)基因pnta的获得：以大肠杆菌(E.coli DH5 α)基因组作为PCR反 应模板，利用含有BamHI限制性酶切位点的引物PNTA F，含有Hind III限制 性酶切位点的引物PNTA_R，通过PCR扩增反应，获得pnta基因，其全长为 1530bp；

PNTA_F：5’-CGCGGATCCATGCGAATTGGCATACCAAG-3’，

PNTA_R：5’-CCCAAGCTTTTAATTTTTGCGGAACATTTTC-3’；

PCR反应体系：ddH2O 37μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP 0.5μL，50pmol/μL的引物PNTA_F和PNTA_R各1μL，大肠杆菌基因组5μL， 5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，进行30个循环；72℃延伸10min；获得pnta 基因；

(6)重组质粒pETDuet-rcr-scr的构建：

先利用限制性内切酶NdeI和XhoI对基因rcr和载体pETDuetTM-1分别进行 双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因rcr的重组质 粒pETDuet-rcr；再利用限制性内切酶EcoRI和NotI对基因scr和载体 pETDuet-rcr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得 带有两个目的基因rcr和scr的重组质粒pETDuet-rcr-scr；

(7)重组质粒pACYCDuet-pnta-pntb的构建：

先利用限制性内切酶EcoRV和XhoI对基因pntb和载体pACYCDuetTM-1分 别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因pntb 的重组质粒pACYCDuet-pntb；再利用限制性内切酶BamHI和HindIII对目的基 因pnta和载体pACYCDuet-pntb分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘 性末端连接，获得带有两个目的基因pnta和pntb的重组质粒 pACYCDuet-pnta-pntb；

(8)重组质粒共转化大肠杆菌

取重组质粒pETDuet-rcr-scr和pACYCDuet-pnta-pntb各2μL，共转化大肠 杆菌E.coli BL21(DE3)惑受态细胞，转化液涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素 和34μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性克隆E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)；

3、重组菌E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr/pACYCDuet-pnta-pntb)的诱导培 养，其特征是采用LB培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10， pH 7.0；固体培养基添加培养基重量1.5％的琼脂粉；

挑取阳性克隆单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯 霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转 接于50mL含100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB液体培养基中， 于37℃、200rpm振荡培养至OD600为0.6；加入诱导物异丙基-B-D-硫代半乳糖 苷1mmol/L，30℃下诱导培养酶偶联重组菌E.coli BL21(pETDuet-rcr-scr /pACYCDuet-pnta-pntb)10h。

4、利用培养后的酶偶联重组菌CCTCC NO：M208126不对称转化制备(S)- 苯基乙二醇的方法，其特征是以(R)-苯基乙二醇为底物，进行不对称转化反应： 在1mL0.1mol/L pH5.0～6.0的醋酸缓冲液，或1mL0.1mol/L pH 6.5～7.0的磷酸缓 冲液，或1mL0.1mol/L pH 7.5～8.0的Tris-HCl缓冲液中，(R)-苯基乙二醇底物浓 度为105mmol/L，5mmol/L硫酸锌，重组菌细胞浓度为0.1g/mL，30℃下反 应48h，产物为(S)-苯基乙二醇。