1.一株不对称转化制备(R)-苯基乙二醇的重组菌，其分类命名为大肠杆菌

(Escherichia coli)BL21/pET32a-mrcr，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M209289。

2.根据权利要求1所述重组菌CCTCC NO：M209289的构建方法，其特征是将突变基因mrcr插入载体pET32a构建重组质粒pET32a-mrcr，重组质粒pET32a-mrcr转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选，获得重组菌株E.coli BL21/pET32a-mrcr，即CCTCCNO：M209289；步骤为：①基因的优化：根据MFOLD软件算法，对(R)-羰基还原酶编码基因rCr的mRNA翻译起始区中+1nt～+78nt部分核苷酸进行分析，以降低二级结构的稳定性或自由能ΔG为依据，对13个核苷酸进行了定点突变；即第9，16，17，18，21，52，54，57，58，60，61，63和66位的t，a，g，c，c，c，t，g，t，g，a，a，t突变为A，T，C，A，A，T，A，A，C，A，C，T，C；

②mrcr的获得：以重组质粒pETRCR作为PCR反应模板，利用含有NcoI限制性酶切位点的引物mRCR_F，含有XhoI限制性酶切位点的引物mRCR_R，通过PCR扩增反应，获得mrcr基因，其全长为1008bp；

mRCR_F：5-GACCATGGGATCAATACCATCATCACAATACGGATTCGTATTCAATAAGCAATCAGGATTAAAACTACGTAACGATTTG-3’，mRCR_R：5’-TGACTCTCGAGTGGATTAAAAACAACTCTACCTTCATAAGCATTGTT-3’，PCR反应体系：ddH2O 37.5μL，10×Reaction Buffer 5μL，25mmol/L的dNTP4μL，

50pmol/μL的引物mRCR_F和mRCR_R各1μL，重组质粒pETRCR 1μL，5U/μL的Taq DNA polymerase 0.5μL；

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃

10min；获得mrcr基因；

③重组质粒pET32a-mrcr的构建：先利用限制性内切酶NcoI和XhoI对基因mrcr和载体pET32a分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得带有基因mrcr的重组质粒pET32a-mrcr；

④重组质粒转化大肠杆菌：取重组质粒pET32a-mrcr 2μL，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化液涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得阳性克隆E.coli BL21/pET32a-mrcr。

3.利用定点突变后构建的重组菌CCTCC NO：M209289不对称转化制备(R)-苯基乙二醇，其特征是(1)重组菌株CCTCC NO：M209289的培养

采用LB液体培养基以g/L计：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0；固体培养基再添加液体培养基重量1.5％的琼脂粉；

培养条件：挑取重组菌株CCTCC NO：M209289的单菌落接种于3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养过夜；取1mL培养液转接于50mL含

100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃ 200rpm振荡培养至OD600为0.6～0.8；

加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷1mmol/L，30℃下诱导培养过夜，10,000rpm离心

10min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，收集得到重组菌全细胞；

(2)以重组菌全细胞为催化剂，以2-羟基苯乙酮为底物，进行不对称转化反应：5mL

0.1mol/L pH 5.0～6.0的醋酸缓冲液，或5mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液，或5mL

0.1mol/L pH 8.0～9.0的Tris-HCl缓冲液中，重组菌全细胞浓度为0.1～0.2g/mL，底物浓度为5g/L，反应温度30℃，反应时间为48h。