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专利号: 2010102045352
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种微生物催化法制备2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法,所述方法包括:在以2-氨基-2,3-二甲基丁腈为底物,以庆笙红球菌(Rhodococcusqingshengii)CCTCC No:M 2010050、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)CCTCC No:M 209214或红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCNo:M 209244发酵产生的腈水合酶为催化剂的反应体系中,于pH6.0~10.0、20~40℃下进行催化水合反应,制得所述的2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述反应在水或pH6.0~10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中进行

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述反应体系中底物初始浓度为0.03~

0.3M。

4.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述腈水合酶来自庆笙红球菌CCTCC No:M

2010050、小球诺卡氏菌CCTCC No:M 209214或红平红球菌CCTCC No:M 209244经发酵获得的含酶菌体细胞,所述含酶菌体细胞在反应体系中添加量以含酶细胞湿重计为5~50g/L。

5.如权利要求4所述的方法,其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到:

(1)将经斜面活化的庆笙红球菌CCTCC No:M 2010050、小球诺卡氏菌CCTCC No:M

209214或红平红球菌CCTCC No:M 209244接入种子培养基中,于20~40℃下培养24~

48h,获得种子液;

所述种子培养基终浓度组成如下:葡萄糖5~20.0g/L,酵母浸出粉2~8.0g/L,蛋白胨1~4.0g/L,KH2PO40.5~1.5g/L,K2HPO40.5~1.5g/L,NaCl 0.5~3.0g/L,己内酰胺

0.5~2.0g/L,MgSO40.05~0.2g/L,CoCl20.01~0.05g/L,FeSO40.01~0.05g/L,溶剂为水,pH 6.0~8.0;

(2)将种子液以1~10%体积比接入产酶培养基中,于20~40℃下培养48~96h,培养得到的发酵液经离心或膜分离,得所述含酶菌体细胞;所述产酶培养基终浓度组成如下:蔗糖5.0~10.0g/L,柠檬酸钠2.0~5.0g/L,牛肉膏2.0~8.0g/L,酵母粉2.0~8.0g/L,氯化钠0.5~2.0g/L,磷酸二氢钾0.5~2.5g/L,氯化钴0.005~0.01g/L,氯化铁0.005~

0.01g/L,氯化锰0.005~0.01g/L,诱导剂1.0~3.0g/L,溶剂为水,pH 6.0~8.0;所述诱导剂为下列之一:谷氨酸钠、2,2-二甲基环丙甲酰胺、己内酰胺、丙烯酰胺、乙酰胺或尿素。

6.如权利要求4或5所述的方法,其特征在于所述方法如下:将所述含酶菌体细胞用生理盐水洗涤后,悬浮于水或pH6.0~10.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中,加入底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈至底物浓度为0.03~0.3M,于15~40℃、100~200rpm下反应10~60min;反应结束后,转化液经分离纯化得到所述2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。

7.如权利要求6所述的方法,其特征在于所述分离纯化方法如下:反应结束后,取转化液12000rpm离心10min,收集上清液;加入粉末活性炭,加热搅拌脱色30min后转入真空抽滤装置抽滤,得到脱色清液;脱色清液转入旋转蒸发仪,在真空度-0.1Mpa,水浴加热温度

40~60℃、转速60~100rpm条件下减压蒸发除去底物2-氨基-2,3-二甲基丁腈和水,冷却得到2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺粗品;将2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺粗品溶于20~

65℃的乙酸乙酯,加入体积为乙酸乙酯体积10%盐析剂正己烷,于0~4℃保温结晶;过滤,取滤渣用正己烷洗涤,干燥得到2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺晶体。

8.庆笙红球菌(Rhodococcus qingshengii)ZJB-09153,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,430072,保藏编号CCTCCNo:M 2010050,保藏日期2010年3月10日。

9.小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)ZJB-09141,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,430072,保藏编号CCTCCNo:M 209214,保藏日期2009年9月27日。