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专利号: 2011100753483
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述方法是以乙酰乙酸叔丁酯为底物,以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂,进行转化反应制得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。

2.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述的方法为:反应体系以pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液为反应溶剂,以乙酰乙酸叔丁酯为底物、以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂,于25~45℃下转化反应8~40小时,反应结束后,转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。

3.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述的乙酰乙酸叔丁酯在反应体系中的初始终浓度为1~100mmol/L。

4.如权利要求2所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述的反应体系中还添加有终浓度为5~20%的乙醇作为辅助底物。

5.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述的含酶菌体细胞用量以细胞干重计为1~20g/g乙酰乙酸叔丁酯。

6.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述的含酶菌体细胞按照以下方法制备:将酿酒酵母CGMCC No.2266接种至发酵培养基中,摇床转速为150~200r/min,26~35℃下培养18~30h,将发酵液离心,制得含酶菌体细胞。

7.如权利要求2所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述的(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯分离纯化方法如下:反应结束后,将转化液4000r/min离心20分钟,弃去菌体沉淀,将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分,抽滤,取滤液蒸馏除去乙酸乙酯,即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。

8.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述的方法按照以下步骤进行:(1)斜面培养:将酿酒酵母CGMCCNo.2266接种到斜面培养基,26~35℃培养4~6天得菌体斜面;(2)种子培养:从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基,摇床转速为150~200r/min,26~35℃培养18~26h得种子液;(3)发酵培养:取种子液,以体积分数10~20%的接种量接种于发酵培养基中,摇床转速为150~

200r/min,26~35℃培养18~30h,将发酵液离心分离得到所述含酶菌体细胞;(4)生物转化:在pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液中,添加终浓度为5~20%的乙醇作为辅助底物,加入终浓度为1~100mmol/L的乙酰乙酸叔丁酯为底物,以及相当于细胞干重质量为乙酰乙酸叔丁酯1~20倍的含酶菌体细胞,25~45℃下转化反应8~40小时,反应结束制得转化液;(5)分离纯化:转化反应结束后,将转化液于4000r/min离心20分钟,弃去菌体沉淀,将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分,抽滤,滤液蒸馏除去乙酸乙酯,即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。

9.如权利要求1所述微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法,其特征在于所述方法按如下步骤进行:

(1)斜面培养:将酿酒酵母CGMCC No.2266接种到斜面培养基,26~35℃培养4~6天得菌体斜面;所述的斜面培养基终浓度组成为:麦芽汁5~15g/L,酵母粉2~4g/L,蛋白胨

4~6g/L,葡萄糖7~12g/L,琼脂15~25g/L,自然pH值,溶剂为水;

(2)种子培养:从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基,26~35℃,摇床转速为

150~200r/min,培养18~26h得种子液;所述的种子培养基终浓度组成为:葡萄糖26~

32g/L,酵母粉2~4g/L,硫酸铵3~6g/L,无水MgSO4 0.2~0.4g/L,K2HPO4·3H2O 0.5~

1.5g/L,KH2PO4 0.6~1.5g/L,用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0,溶剂为水;

(3)发酵培养:取种子液,以体积分数为10~20%的接种量接种于发酵培养基中,培养温度为26~35℃,摇床转速为150~200r/min,培养18~30h得到含有含酶菌体细胞的发酵液,离心分离得到所述含酶菌体细胞;所述发酵培养基终浓度组成为:葡萄糖26~32g/L,酵母粉2~4g/L,硫酸铵3~6g/L,无水MgSO4 0.2~0.4g/L,K2HPO4·3H2O 0.5~1.5g/L,KH2PO4 0.6~1.5g/L,用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0,溶剂为水;

(4)生物转化:在pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液中,加入终浓度为1~20mmol/L的乙酰乙酸叔丁酯为底物,添加终浓度为5~15%的乙醇作为辅助底物,以及相当于细胞干重质量为乙酰乙酸叔丁酯1~10倍的含酶菌体细胞,于25~45℃下转化反应8~40小时得转化液;

(5)分离纯化:反应结束后,将转化液于4000r/min离心20分钟,弃去菌体沉淀,将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分,抽滤,取滤液蒸馏除去乙酸乙酯,即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。