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专利号: 2011104465343
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述方法为:(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇体积终浓度为35~45%,在-20℃下沉淀后,离心收集上清液A,丢弃杂质沉淀A;所述PCR扩增产物中还包含0~0.3mM焦磷酸、0~20.0nM寡核苷酸引物链、0~26.7μM核苷酸和0~0.1U Taq聚合酶;(2)取所述的上清液A加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为60~75%,在-20℃下再沉淀后,离心,除去上清液B,收集沉淀B;(3)取沉淀B用体积浓度为75%乙醇水溶液洗涤后,离心,除去上清液C,收集沉淀C;(4)50℃烘干沉淀C后,再加入TE溶液溶解,获得纯化后的DNA。

2.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述步骤(1)中加入无水乙醇使得到的混合液乙醇体积终浓度为38~42%。

3.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述步骤(2)中上清液A加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为63~70%。

4.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述方法按如下步骤进行:(1)在PCR扩增产物中加入无水乙醇使得到的混合液中乙醇体积终浓度为40%,在-20℃下沉淀2h后,13000rpm离心10min收集上清液A,丢弃杂质沉淀A;所述PCR扩增产物还包含0~0.3mM焦磷酸、0~20.0nM寡核苷酸引物链、0~26.7μM核苷酸和0~

0.1U Taq聚合酶;(2)取所述的上清液A加入无水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的体积终浓度为65%,在-20℃下再沉淀2h后,13000rpm离心,除去上清液B,收集沉淀B;

(3)沉淀B用体积浓度为75%乙醇水溶液洗涤后,13000rpm离心10min,除去上清液C,收集沉淀C;(4)50℃烘干沉淀C后,再加入TE溶液溶解,获得纯化后的DNA。

5.如权利要求1~4之一所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述PCR扩增产物按如下方法制备:1)PCR反应体系:人基因组DNA,引物,终浓度为250μM的dNTPs,50mM KCl,10mM Tris-HCl,1.5mM MgCl2和1U的Taq聚合酶;所述dNTPs由下列组分构成:终浓度为62.5μM的dATP、62.5μM的dTTP、62.5μM的dCTP和62.5μM的dGTP;

2)PCR扩增程序为:94℃变性5min,然后是35个循环,每个循环为94℃变性1min,55℃退火50s,72℃延伸1min,循环结束后,72℃再延伸10min,获得PCR扩增产物;所述PCR扩增产物中还包含0~0.3mM焦磷酸、0~20.0nM寡核苷酸引物链、0~26.7μM核苷酸和0~

0.1U Taq聚合酶。

6.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述PCR扩增产物为185~2085bp。

7.如权利要求1所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述PCR扩增产物包含SNP位点。

8.如权利要求5所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述PCR扩增产物大小723bps,包含1个SNP位点,所述SNP位点为5’-(G/G)T-3;所述模板为人基因组DNA,所述的引物为:上游引物F2:5’GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3’和下游引物R2:

5’GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3’。

9.如权利要求5所述的用乙醇分级沉淀纯化DNA的方法,其特征在于所述人基因组DNA终浓度为10ng,引物为终浓度100nM的上游引物F2:5’GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3’和

100nM的下游引物R2:5’GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3’。