1.一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的测定方法包括如下步骤：

①试剂准备：准备浓度为0.1mol/LpH7.5的Tris·Cl缓冲液、体积分数10%的三氯乙酸溶液、0.6~0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液、0.3mmol/L的羟脯氨酸标准液、2mol/L的乙酸缓冲液、茚三酮显色液、体积分数60%的醇溶液；

②羟脯氨酸样品制备：分别移取羟脯氨酸标准液适量于比色管中稀释定容至同一体积，制成浓度为0.03~0.3μmol/mL的若干羟脯氨酸样品，取与羟脯氨酸样品相同体积的蒸馏水于比色管中作为参照样品；

③羟脯氨酸样品测定：向参照样品和各羟脯氨酸样品中分别加入与羟脯氨酸样品体积相等的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于100~105℃水浴加热15~20min，冷却，放置10min，然后加入羟脯氨酸样品体积3倍的醇溶液稀释，以参照样品为参比溶液，在

520nm处测各羟脯氨酸样品的吸光值，根据羟脯氨酸样品的浓度C和吸光值A作出C-A标准曲线，并拟合出标准曲线公式；

④待测酶解液制备：称取0.8~1.2mg胶原底物，加入0.4~0.6mlTris·Cl缓冲液，于

35~40℃预热8~12min，加入0.1ml待测酶液，所述待测酶液体积记为V2，于35~40℃酶解反应Tmin，所述T的值为25~35，然后加入0.5~0.7ml三氯乙酸溶液摇匀，接着加入0.5~0.7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入0.4~0.6g硅胶，搅匀后静置5~8min，离心得上清液，该上清液体积记为V1，将所述上清液稀释至浓度0.03~0.3μmol/mL作为待测酶解液，稀释倍数记为N；

⑤空白液制备：称取0.8~1.2mg胶原底物，加入0.4~0.6ml Tris·Cl缓冲液，于

35~40℃预热8~12min，加入0.5~0.7ml三氯乙酸溶液摇匀，然后加入0.1ml待测酶液，于

35~40℃酶解反应25~35min，再加入0.5~0.7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入0.4~0.6g硅胶，搅匀后静置5~8min，离心得上清液，所述上清液稀释N倍后作为空白液；

⑥酶活力的测定：取待测酶解液和空白液适量于比色管中，体积记为V3，分别加入V3体积的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于100~105℃水浴加热15~20min，冷却，放置10min，然后加入3倍V3体积的醇溶液稀释，以空白液为参比溶液，测待测酶解液在

520nm处的吸光值；

⑦测出待测酶解液吸光值A后，代入步骤③得到的标准曲线公式中得到对应的待测酶解液中的羟脯氨酸浓度C；

⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：

其中，C为待测酶解液中羟脯氨酸的浓度；V1为上清液体积；MW为羟脯氨酸分子量；N为上清液稀释倍数；V2为待测酶液体积；T为酶解反应时间。

2.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，步骤②中所述适量是指0.1~1.0ml，所述同一体积是指1ml，所述浓度为0.03~0.3μmol/mL的羟脯氨酸样品的数量为6个、7个或8个。

3.根据权利要求2所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述6个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30μmol/mL；所述7个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、0.15、0.18、0.24、0.30μmol/mL；所述8个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.30μmol/mL。

4.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的醇溶液为乙醇溶液或异丙醇溶液。

5.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的胶原底物是指不溶性胶原蛋白或明胶。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的待测酶液是由成品胶原蛋白酶配制成的0.2mg/L的酶液。

7.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的硅胶为细孔硅胶。

8.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，步骤④中上清液稀释至浓度0.12~0.24 μmol/mL作为待测酶解液。