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专利号: 2012102242877
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法,其特征在于所述方法为:

(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上,20-37℃培养至长出单菌落,挑选单菌落,接种至斜面培养基上,20-37℃培养直到菌落长成;所述平皿培养基或斜面培养基的组成为:蔗糖5-30g/l,蛋白胨1-5g/l,酪氨酸0.5-2g/l,K2HPO4.3H2O 0.5-2g/l,KCl 0.5-2g/l,MgSO4.7H2O 0.5-2g/l,FeSO4.7H2O 0.1-1g/l,琼脂15-20g/l,溶剂为水,初始pH 6.0-7.5;

(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养,培养温度25-37℃,摇床转速

150-200rpm,培养1~7天,得到发酵液,取发酵液于4000-12000rpm离心,取上清液备用;

所述发酵培养基的组成为:麦芽糖10-120g/l,葡萄糖10-50g/l,黄豆饼粉5-25g/l,碳酸钙

2-10g/l,甘油2-10g/l,谷氨酸钠2-10g/l,溶剂为水,初始pH6.0-7.5;

(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释10-100倍,即为待测样品,在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30gl,所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml,每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U,5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40gl,pH6.0、-1

50mmol·L 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl,40μl待测样品;对照组为:所述唾液淀粉酶30μl,所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml,5mmol/12-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽-1糖苷40μl,pH6.0、50mmol·L 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl,用酶标仪于405nm处检测Abs405,每5秒读一次数,直至Abs405不再增加,将Abs405相对于对照组降低30%以上的样品孔标记为阳性菌株,并保存阳性菌株。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述平皿培养基或斜面培养基按以下方法制得:水中加入琼脂条,边加热边搅拌,直到完全溶解,然后加入蔗糖,蛋白胨,酪氨酸,K2HPO4·3H2O,KCl,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O,并搅拌至完全溶解,配制得到终浓度为:蔗糖5-30g/l,蛋白胨1-5g/l,酪氨酸0.5-2g/l,K2HPO4·3H2O 0.5-2g/l,KCl 0.5-2g/l,MgSO4·7H2O 0.5-2g/l,FeSO4/7H2O 0.1-1g/l,琼脂15-20g/l的溶液,调节pH 6.0-7.5,

121℃灭菌20min,冷却到60℃,在无菌条件下,倒入无菌的试管中,摆放斜面,冷却得到斜面培养基;在无菌条件下倒入无菌的平皿中,冷却得到平皿培养基。

3.如权利要求1所述的α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法,其特征在于所述方法为:

(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上,28℃培养至长出单菌落,挑选单菌落,接种至斜面培养基上,28℃培养直到菌落长成;所述平皿培养基或斜面培养基的组成为:蔗糖

25~30g/l,蛋白胨2g/l,酪氨酸1g/l,K2HPO4·3H2O 0.5-1g/l,KCl 0.5g/l,MgSO4·7H2O

0.5g/l,FeSO4·7H2O 0.1g/l,琼脂20g/l,溶剂为水,初始pH7.0;

(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养,培养温度28℃,摇床转速

150~200rpm,培养7天,得到发酵液,取发酵液于10000~12000rpm离心,取上清液备用;

所述发酵培养基的组成为:麦芽糖40-80g/L,葡萄糖20-40g/L,黄豆饼粉10-15g/L,碳酸钙

5g/L,甘油5g/L,谷氨酸钠5g/L,溶剂为水,初始pH 7.0;

(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释25-100倍,即为待测样品,在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30gl,所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml,每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U,5 mmol/l的2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl,pH6.0、

50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90μl,40μl待测样品;对照组为:所述唾液淀粉酶

30μl,所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml,5mmol/l2-氯-4-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷40μl,pH6.0、50mmol/l磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液130μl,用酶标仪于405nm处检测Abs405,每5秒读一次数,直至Abs405不再增加,将Abs405相对于对照组降低30%以上的样品孔标记为阳性菌株,并保存阳性菌株。