欢迎来到知嘟嘟! 联系电话:13095918853 卖家免费入驻,海量在线求购! 卖家免费入驻,海量在线求购!
知嘟嘟
我要发布
联系电话:13095918853
知嘟嘟经纪人
收藏
专利号: 2012102846186
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
价格&联系人
年费信息
委托购买

摘要:

权利要求书:

1.用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述方法为:(1)普鲁士蓝琼脂平板的制备:将10~30g/L氯化铁水溶液与10~30g/L铁氰化钾水溶液以体积比0.2~6:1混合制成混合液,然后将混合液与MM琼脂液以体积比1:5~

20混合摇匀,在115℃下灭菌30min,倒平板,制成所述普鲁士蓝琼脂平板;所述MM琼脂液终浓度组成为:酵母膏0~10g/L、蛋白胨2~20g/L和琼脂15~30g/L,pH5~9,溶剂为水;(2)L-氨基酸氧化酶活力的测定:取步骤(1)制得的普鲁士蓝琼脂平板,用打孔器在所述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为4~10mm的小孔,然后将小孔中加入待测液,室温静置

10~300min,待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈,测定蓝色圈的直径,根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量,从而推论得L-氨基酸氧化酶活力;所述的过氧化氢与蓝色圈直径的标准直线是以所取用步骤(2)同样的普鲁士蓝琼脂平板以梯度浓度的标准过氧化氢为测试样品做与待测液平行试验取得的数据得到的标准浓度的过氧化氢与蓝色圈直径线性关系图;所述待测液的制备方法为:以交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas sp.B3)发酵培养获得的酶为酶源,以待测L-氨基酸为底物,25~

50℃,pH5~9条件下反应0.5~2h,获得的反应液即为待测液;所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液,所述L-氨基酸初始底物浓度为2~20mmol/L,所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.5~

10mg湿菌体/mmol底物;所述L-氨基酸氧化酶活力的定义为:30℃下,1mL酶液作用底物浓度为5mmol/L的L-氨基酸1h后释放出1mmol/L过氧化氢即为1个酶活单位U。

2.如权利要求1所述用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述氯化铁水溶液的质量浓度均为15~25g/L,所述铁氰化钾水溶液的质量浓度为

15~25g/L。

3.如权利要求1所述用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述氯化铁水溶液和铁氰化钾水溶液的体积配比为0.4~2.5:1,所述氯化铁水溶液和铁氰化钾水溶液的混合液与MM琼脂液体积配比为1:7~15。

4.如权利要求1所述用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述MM琼脂液终浓度组成为:酵母膏2~5g/L、蛋白胨3~7g/L和琼脂18~25g/L,pH6~8,溶剂为水。

5.如权利要求1所述用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述打孔器打出小孔的直径为5~7mm。

6.如权利要求1所述用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述每孔中加入的待测液为30~70μL。

7.如权利要求1所述用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述小孔加入待测液后室温静置15~60min。

8.如权利要求1所述用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述L-氨基酸为L-亮氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、L-胱氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬酰胺、L-高苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苯甘氨醇或L-缬氨酸。

9.如权利要求1所述用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述酶源按如下步骤制备:(1)斜面培养:将交替假单胞菌B3接种于斜面培养基,

20~37℃培养12~24h,获得斜面菌体,所述斜面培养基终浓度组成为:酵母膏1.5~6g/L、蛋白胨2.5~10g/L、海盐15~45g/L和琼脂15~25g/L,pH7~8,溶剂为水;(2)种子培养:从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基,20~37℃培养18~24h,获得种子液,所述种子培养基终浓度组成为:酵母膏1.5~6g/L、蛋白胨2.5~10g/L和海盐

15~45g/L,pH7~8,溶剂为水;(3)发酵培养:将种子液以体积浓度1~10%的接种量接种至发酵培养基,20~37℃培养48~120h,获得发酵液,将发酵液经8000~12000rpm,离心5~10min后,弃去沉淀,收集上清液,获得所述酶源;所述发酵培养基终浓度组成为:酵母膏1.5~6g/L,蛋白胨2.5~10g/L和海盐15~45g/L,pH7~8,溶剂为水。