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专利号: 2012104886262
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.肝素酶II在解聚肝素前体(Heparosan)制备低分子量肝素(Low Molecular Weight Heparin,LMWH)中的应用。

2.如权利要求1所述的应用,其特征在于所述应用为:以肝素前体为反应底物,加入肝素酶II进行解聚,解聚后的产物再经进一步脱乙酰、硫酸化和异构化修饰,制得所述低分子量肝素。

3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述解聚在25℃下进行,反应时间1.5h。

4.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述解聚在缓冲液中进行,缓冲液组成如下:乙酸钠100 mM,BSA 0.01%,乙酸钙10 mM,溶剂为水,pH7.0。

5.如权利要求1~4之一所述的应用,其特征在于所述肝素酶II为重组肝素酶II。

6.一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法,所述方法包括:(1)从肝素黄杆菌基因组DNA扩增得到肝素酶II基因片段,克隆到pET-15b表达载体中,获得重组载体pET15b-hepB,pET15b-hepB转化E. coli BL21(DE3)获得重组菌E. coli BL21(DE3) /pET15b-hepB,重组菌经乳糖诱导后,菌液经细胞破碎后提取目标蛋白,获得重组肝素酶II;

(2)Heparosan与重组肝素酶II在缓冲液中于25℃下反应1.5h,反应液经分离纯化,得到解聚后的Heparosan;所述缓冲液组成为:乙酸钠100 mM,BSA 0.01%,乙酸钙10 mM,溶剂为水,pH7.0;缓冲液中Heparosan初始浓度为0.01~0.1g/mL,重组肝素酶II初始添加量为100~500U/mL;

(3)解聚后的Heparosan进一步进行脱乙酰、硫酸化和异构化,制得所述低分子量肝素。