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专利号: 201310022527X
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 一般的物理或化学的方法或装置
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种肌氨酸氧化酶亲和介质,其特征在于,所述肌氨酸氧化酶亲和介质由肌氨酸氧化酶亲和配体和层析介质连接而成;肌氨酸氧化酶亲和配体和层析介质通过乙二胺作为间隔臂进行连接;

所述肌氨酸氧化酶亲和配体是4-氨基吡咯-2-羧酸,所述层析介质是Sepharose或聚壳聚糖;

即肌氨酸氧化酶亲和介质为:

A、Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸,或B、聚壳聚糖-4-氨基吡咯-2-羧酸。

2.权利要求1所述肌氨酸氧化酶亲和介质的合成方法,其特征在于:

A、Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸的合成:

(1)介质活化:100 g Sepharose CL 4B用10倍量的去离子水-记为体积V-洗涤,抽干成湿饼状;悬浮于50 mL缓冲液,40℃摇床震荡2.5 h,然后倒入玻璃磨砂漏斗中,在抽滤下经过每次V体积的蒸馏水洗涤,直到洗涤液pH至中性,再抽干成湿饼状,得活化的Sepharose CL 4B;

所述缓冲液为0.8 M NaOH、20%二甲亚砜和10%环氧氯丙烷的溶液,下同;

(2)接间隔臂乙二胺:活化的Sepharose CL 4B层析介质悬浮于100 mL去离子水中,按照1:2的摩尔比例加入乙二胺,凝胶在搅拌下60 ℃恒温12 h;用去离子水清洗;所得氨基-Sepharose CL 4 B再次悬浮在50mL的缓冲液中,40℃摇床震荡2.5 h,然后倒入玻璃磨砂漏斗中,在抽滤下经过每次V体积的蒸馏水洗涤,直到洗涤液pH至中性,再抽干成湿饼状,获得活化的氨基-Sepharose CL 4B介质;

(3)连接亲和配体:称取1g 4-氨基吡咯-2-羧酸,溶解于80 mL去离子水中,加入已抽干的活化氨基-Sepharose CL 4B介质,在50-60℃振荡24 h,反应过程中时常检查pH,用1M NaOH使溶液保持在11-12之间;反应完毕,用500 mL去离子水充分洗涤,抽干,得Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸;

B、聚壳聚糖-4-氨基吡咯-2-羧酸的合成

(ⅰ)介质活化:100 g聚壳聚糖用10倍量的去离子水-记为体积V-洗涤,抽干成湿饼状;悬浮于50 mL 缓冲液,40 ℃摇床震荡2.5 h,然后倒入玻璃磨砂漏斗中,在抽滤下经过每次V体积的蒸馏水洗涤,直到洗涤液pH至中性,再抽干成湿饼状,得活化的聚壳聚糖介质; (ⅱ)接间隔臂乙二胺:活化的聚壳聚糖介质悬浮于500 mL 0.1M NaOH溶液,加入20 mL乙二胺溶液,凝胶在搅拌下30 ℃恒温12 h;用去离子水清洗;所得NH2-聚壳聚糖悬浮在50 mL 缓冲液中,40 ℃摇床震荡2.5 h,然后倒入玻璃磨砂漏斗中,在抽滤下经过每次V体积的蒸馏水洗涤,直到洗涤液pH至中性,再抽干成湿饼状,获得活化的氨基-聚壳聚糖介质;

(ⅲ)连接亲和配体:称取1 g 的4-氨基吡咯-2-羧酸,溶解于80 mL去离子水中,加入已抽干的活化氨基-聚壳聚糖介质,50-60 ℃振荡24 h,反应过程中时常检查pH,用1M NaOH使溶液保持在11-12之间;反应完毕,用500 mL 去离子水充分洗涤,抽干,得聚壳聚糖-4-氨基吡咯-2-羧酸。

3.一种利用权利要求1所述的肌氨酸氧化酶亲和介质大规模纯化肌氨酸氧化酶的方法,其特征在于,将含有肌氨酸氧化酶的溶液流经所述肌氨酸氧化酶亲和介质进行亲和吸附,然后采用清洗液冲洗所述吸附后的肌氨酸氧化酶亲和介质,最后用洗脱缓冲液洗脱所述肌氨酸氧化酶亲和介质上吸附的肌氨酸氧化酶,从而获得纯化的肌氨酸氧化酶;

(A)所述的含有肌氨酸氧化酶的溶液是采用基因工程方法获得的肌氨酸氧化酶表达液;

所述肌氨酸氧化酶表达液是复制来自于玫瑰红嗜热菌(Thermomicrobium roseum )DSM 5159的肌氨酸氧化酶基因SEQ ID NO: 1,并由大肠杆菌(Escherichia coli)JM109 表达得到;

(B)所述亲和吸附的条件为pH 7.5~8.7,电导率为2~5 mS/cm;

(C)采用清洗液冲洗所述肌氨酸氧化酶亲和介质的清洗条件为pH值7.5~8.7,电导率

5~10 mS/cm;

(D)用洗脱缓冲液洗脱所述肌氨酸氧化酶亲和介质上吸附的肌氨酸氧化酶的洗脱条件为pH值8.5~9.5,电导率40~80 mS/cm。