1.一种利用二甲酚橙琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法,所述方法包括:(1)二甲酚橙琼脂平板的制备:以水为溶剂,配制含有0.05~0.4mmol/L FeSO4、
0.04~0.3mmol/L二甲酚橙和15~30g/L琼脂的水溶液,煮沸溶解,倒平板,冷却凝固后制成二甲酚橙琼脂平板;
(2)待测液的制备:以0.2~20mmol/L的L-亮氨酸为底物,加入含L-氨基酸氧化酶待测酶液作为酶源,于25~50℃、pH5~9条件下反应0.5~2h,获得的反应液用水经稀释后即为待测液;
(3)L-氨基酸氧化酶活力的测定:用打孔器在二甲酚橙琼脂平板上打出直径为4~
10mm的小孔,然后往小孔中加入待测液,室温静置20~100min后,测定紫红色圈的直径;
(4)标准曲线绘制:配制梯度浓度的过氧化氢溶液,按照步骤(3)方法进行检测,以过氧化氢浓度为横坐标、紫红色圈直径为纵坐标,绘制标准曲线;
(5)结果判定:根据待测液的紫红色圈直径,对照标准曲线,获得待测液中过氧化氢的浓度值,从而获得L-氨基酸氧化酶活力数据;L-氨基酸氧化酶活力的定义为:1μL酶液作用底物浓度为10mmol/L的L-氨基酸1h后释放出1mmol/L过氧化氢即为1个酶活单位U。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)所述二甲酚橙琼脂平板中FeSO4浓度为0.20~0.30mmol/L,二甲酚橙浓度为0.10~0.20mmol/L,琼脂浓度为18~25g/L;步骤(2)中所述L-氨基酸氧化酶待测酶液来自东部菱背响尾蛇(Crotalus adamanteus);步骤(3)中每孔加入待测液30~70μL。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述方法如下:
(1)二甲酚橙琼脂平板的制备:将1mmol/L的FeSO4水溶液、0.6mmol/L的二甲酚橙水溶液与40g/L的琼脂水溶液以体积比1:1:2混合,摇匀,煮沸溶解,倒平板,冷却凝固后制成二甲酚橙琼脂平板;
(2)待测液的制备:在3mL、10mmol/L的L-亮氨酸底物溶液中,加入1μL的L-氨基酸氧化酶待测酶液作为酶源,于30℃、pH7.5条件下反应0.5h,获得的反应液用水稀释即为待测液;
(3)L-氨基酸氧化酶活力的测定:用打孔器在二甲酚橙琼脂平板上打出直径6mm的小孔,然后往小孔中加入50μL待测液,室温静置60min后,测定紫红色圈的直径;
(4)标准曲线绘制:配制梯度浓度的过氧化氢溶液,按照步骤(3)方法进行检测,以过氧化氢浓度为横坐标、紫红色圈直径为纵坐标,绘制标准曲线;
(5)结果判定:根据待测液的紫红色圈直径,对照标准曲线,获得待测液中过氧化氢的浓度值,从而获得L-氨基酸氧化酶活力数据。