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专利号: 2013104458387
申请人: 河南科技学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种用于检测锌离子的酶联免疫试剂盒,其特征在于:包括包被Zn2+-DTPA-BSA并封闭好的96孔或48孔酶标板,以Zn2+-DTPA-BSA为抗原制备的单克隆抗体mAb,酶标二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体标记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP,Zn2+螯合物配置的标准品稀释液,洗液为0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05%Tween-20,底物显色剂A为过氧化脲,底物显色剂B为四甲基联苯胺,终止液为2mol/L的硫酸溶液;

其中Zn2+-DTPA-BSA制备方法为,

(1)称取牛血清白蛋白(BSA)20mg溶于1mL浓度为10mmoL/L,pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液(HBS)中形成BSA溶液;

(2)称取10mg金属鳌合剂对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTPA)溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中形成金属鳌合剂溶液;取100uL金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5mL BSA溶液中,用10mol/L KOH调节pH至9.0,室温下反应24h;

(3)再取16μL浓度为733.7mmoL/L锌溶液滴加到已反应过的载体蛋白溶液中,用NaOH调节pH值至9.0,室温摇床反应24h,然后移入透析袋中透析5d;

(4)制备出锌离子人工抗原Zn2+-DTPA-BSA,-20℃保存备用;

酶标板上用Zn2+-DTPA-BSA包被,包被蛋白质浓度为0.05mg/mL;单克隆抗体mAb的工作浓度为1∶3.2×105。

2.根据权利要求1所述的锌离子酶联免疫试剂盒,其特征在于:所述的单克隆抗体由以下步骤制备:用Zn2+-DTPA-BSA免疫6周龄雌性BALB/C小鼠,采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞,在聚乙二醇-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合;用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选,选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化,扩大培养、冻存并鉴定,获得一株杂交瘤细胞株;之后采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体mAb。

3.根据权利要求1所述锌离子酶联免疫试剂盒,其特征在于:其检测操作包括以下步骤:

(1)样品前处理方法:用0.1mol/L EDTA螯合物溶液处理待检样品,离心取上清液用于检测;

(2)加样步骤:第一步,除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外,每孔加入50μL工作浓度的C1号液单克隆抗体mAb,同时加入等体积Zn2+螯合物配置的标准品稀释液,其他孔根据检测要求加入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液单克隆抗体mAb,混匀后37℃温育15min,反应后用PBST洗板;

第二步,每孔加入50μL工作浓度的RaMIgG-HRP/GaMIgG-HRP,37℃温育25min,PBST洗板;

第三步,每孔加入100μL的底物显色剂A、底物显色剂B混合液显色,室温反应5min,每孔加入100μL终止液,用酶标仪读A450值,记录结果;

(3)分析检测结果:将第一排的Zn2+螯合物配置的标准品稀释液显色的OD值进行数据处理,得出回归方程式,然后将待检样品的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算,乘以稀释倍数后得出待测样品中锌离子的含量。

4.根据权利要求1所述锌离子酶联免疫试剂盒,其特征在于:最低检测限为0.248μg/L,检测范围为3.774~442.39μg/L。