1.一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织等样品中的铜离子含量的酶联免疫试剂盒。

2.根据权利要求1所述用于检测铜离子的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被

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Cu -ITCBE-OVA或Cu -ITCBE-BSA并封闭好的96孔或48孔酶标板，以Cu -ITCBE-OVA或

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Cu -ITCBE-BSA为抗原制备的铜离子多克隆或单克隆抗体Cu+mAb或pAb，酶标二抗为兔抗

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鼠或羊抗鼠抗体标记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，Cu 螯合物配置的标准品稀释液，洗液为0.01mol／L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20(PBST)，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺(TMB)，终止液为2mol／L的硫酸溶液。

3.根据权利要求2所述用于检测铜离子的酶联免疫试剂盒，其特征在于以

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Cu -ITCBE-OVA或Cu -ITCBE-BSA为抗原制备的铜离子多克隆或单克隆抗体Cu+mAb或pAb通过包括以下步骤在内的制备方法制备得到：(1)铜离子螯合物的合成：通过双功能螯合剂1-(4-异硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)，对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTpA)，2-(4-异硫氰根苯基-1，4，7，

10-四氮环十二烷四盐酸盐(P-SCN-Bn-DOTA)将铜离子螯合链接在载体蛋白；

(2)采用了血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)两种载体蛋白分别制备了相应的人工抗原，采用异硫氰酸酷法将金属双功能鳌合剂1-(4-异硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)与载体蛋白偶联再与铜离子结合得到相应的人工抗原Cu-ITCBE-KLH、Cu-ITCBE-BsA和Cu-ITCBE-OVA；

(3)免疫动物：以Balb／c小鼠和新西兰大白兔作为实验动物，背部皮下多点注射，首免用弗氏完全佐剂(CFA)，加强免疫用弗氏不完全佐剂(CFA)，共免疫5次。用兔血清做多克隆抗体，以小鼠用于单克隆抗体的制作；

(4)用Cu-ITCBE-KLH和Cu-ITCBE-BsA免疫6周雌性BALB／C小鼠5只，剂量为

20μg/0.2mL／只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株：之后采用体内诱生腹水法制备抗铜离子螯合物的mAb。

4.根据权利要求2所述用于检测铜离子的酶联免疫试剂盒，所述的酶联免疫试剂盒由以下步骤制备：

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(1)包被：酶标板上用Cu -DTPA-BSA包被；

(2)封闭；采用浓度为0.05％的猪血清进行封闭；

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(3)单克隆抗体的制备：用Cu -ITCBE-KLH和Cu -ITCBE-BSA免疫6周龄雌性BALB／C小鼠。采用细胞融合技术，在聚乙二醇-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合，用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养，获得一株杂交瘤细胞株；采用体内诱生腹水法制备抗铜离子螯合物的mAb；

(4)EDTA反应液的配制：称取10mg EDTA溶于10mM HBS缓冲液配制成浓度为

34.2mmoL／L EDTA溶液；

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(5)Cu 标准溶液的配制：称取76.7mg硝酸铜溶于100μL 浓硝酸，充分溶解后加超纯水使终体积为1mL，形成浓度为409mmoL／L铜溶液。与EDTA溶液混匀后，用NaOH调节pH

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值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu -EDTA鳌合物溶液；

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将100μg／mL的Cu 标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg／mL、0.25μg／mL、

0.5μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL的浓度梯度，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果；计算出所螯合物种的铜离子含量；

(6)二抗的配制：酶标二抗RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP按照1：1000的工作浓度用洗液稀释分装；

(7)底物、显色液与洗液的配制：底物、显色液与洗液分装配制。洗液为0.01mol／L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20(PBST)；

(8)终止液为2mol／L的硫酸溶液。

5.根据权利要求2所述用于检测铜离子的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的检测

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抗原为Cu -ITCBE-OVA或Cu -ITCBE-BSA，抗原的制备方法包括如下步骤：(1)称取76.7mg硝酸铜溶于浓硝酸，溶解后加超纯水使终体积为1mL，形成浓度为

409mmoL／L铜溶液；

(2)分别称取20mg载体蛋白溶于1mL浓度为10mmoL／L HBS中形成蛋白溶液；

(3)称取10mg金属鳌合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)溶于1mL二甲基亚飒(DMSO)中形成23nmoL／L金属鳌合剂溶液；

(4)取160uL ITCBE溶液，逐滴滴加到(2)中，用NaOH调节pH值，室温反应24h，形成蛋白金属鳌合剂；

(5)取16μL铜溶液滴加到(4)中，用NaOH调节pH值，室温反应24h，透析后为纯化的

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铜离子鳌合后的人工抗原；Cu -ITCBE-Proten，用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定人工抗原中的蛋白浓度。

6.权利要求1-5任意一项所述的检测铜离子的酶联免疫试剂盒在检测铜离子浓度中的应用，优选用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织中铜离子的浓度。

7.根据权利要求6所述的应用，其检测操作包括以下步骤：A1、样品前处理方法：用0.1mol／L EDTA溶液处理样品，离心取上清液用于检测；

A2、检测步骤：第一步除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入

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50μL工作浓度的C1号液Gu mAb，同时加入等体积铜离子标准液，其他孔根据检测要求加

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入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的C1号液Cu mAb，混匀后37℃温育15min，反应后用PBST洗板；第二步每孔加入50μL工作浓度的RaRIgG-HRP，37℃温育25min，PBST洗板；第三步每孔加入100μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100μL终止液，用酶标仪读A450值，记录结果；

A3、分析检测结果：将获得的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算得出待测样品中铜离子的含量。