1.一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织样品中的铜离子含量的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被Cu2+-ITCBE-OVA并封闭好的96孔或48孔酶标板，以Cu2+-ITCBE-BSA为抗原制备的铜离子多克隆或单克隆抗体Cu2+mAb或pAb，酶标二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体标记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，Cu2+螯合物配置的标准品稀释液、洗液PBST为0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺，终止液为2mol/L的硫酸溶液；

2+ 2+

所述抗原Cu -ITCBE-OVA、Cu -ITCBE-BSA的制备步骤如下：(1)铜离子螯合物的改造与鉴定

称取76.7mg纯度为99.99％的硝酸铜溶于100μL纯度为优级的浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1mL，形成浓度为409mmol/L铜溶液；称取10mgEDTA溶于10mM HBS缓冲液配

2+

制EDTA溶液；将两者混匀后，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu -EDTA鳌合物溶液；

将100μg/mL的Cu2+标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果；根据铜离子标准品稀释液绘制的标准曲线计算出所螯合物中的铜离子含量；

(2)铜离子人工抗原的合成与鉴定

分别称取牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA 20mg溶于1mL浓度为10mmol/L，pH9.0的N-

2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液HBS中形成BSA或OVA溶液；

称取10mg金属鳌合剂1-(4-异硫氰基苯基)-乙二胺四乙酸ITCBE溶子1mL二甲基亚砜中形成23nmol/L金属鳌合剂溶液；分别取160μL浓度为23nmol/L的金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到1mLBSA或OVA溶液中，用10mol/LNaOH调节pH至9.0，室温下反应24h；反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内先用10mmol/L，pH9.0 HBS冲洗3次，再用10mmol/L，pH7.4的HBS缓冲液洗2次，除去其中未反应的小分子金属鳌合剂；

取16μL浓度为409mmol/L铜溶液滴加到已反应过的载体蛋白溶液中，用NaOH调节pH值至9.0，室温摇床反应24小时，然后移入透析袋中透析5天；所得产物即分别为纯化的铜离子鳌合后的人工抗原：Cu2+-ITCBE-BSA，包被抗原Cu2+-ITCBE-OVA；用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定人工抗原中的蛋白浓度；

所述单克隆抗体Cu2+mAb、多克隆抗体Cu2+pAb的制备步骤如下：

(1)铜离子单克隆抗体Cu2+mAb的获得

用Cu2+-ITCBE-BSA分别免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为20μg/0.2mL/只，背部皮下分点注射；采用细胞融合技术，在PEG-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA和阻断ELISA进行阳性孔筛选，筛选后进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备Cu2+mAb；用蛋白核酸分析仪在280nm波长下测定所获抗体的IgG含量；

2+

(2)多克隆抗体Cu pAb的获得

用Cu2+-ITCBE-BSA免疫新西兰白兔，免疫剂量为50μg～100μg/次，背部皮下分多点注射；首免，加等量弗氏完全佐剂FCA乳化；加强免疫，加等量弗氏不完全佐剂FIA乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到1∶105以上时，采血并分离收集高免血清；以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用；

所述铜离子检测酶联免疫试剂盒的制备

(1)待标铜离子mAb或pAb的工作浓度

将待标铜离子mAb或pAb溶液10000rpm离心30min，除去杂质；采用方阵法筛选确定铜离子mAb或pAb的工作浓度；铜离子mAb的工作浓度为1∶1.6×105；铜离子pAb的工作浓度为1∶

2.56×105；

(2)铜离子检测酶联免疫试剂盒标准品的制备

称取10mgEDTA溶于10mM HBS缓冲液配制EDTA溶液，将Cu2+标准储备液稀释成0ng/mL、

3.906ng/mL、7.812ng/mL、15.625ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、

500ng/mL、1000ng/mL的浓度梯度，用NaOH调节pH值为6.0，室温摇床反应24小时，即形成Cu2+ 2+-EDTA鳌合物溶液；将100μg/mL的Cu 标准储备液用2％的硝酸稀释成0μg/mL、0.25μg/mL、

0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的浓度梯度，仪器软件自动绘制标准曲线，并得出线性回归方程；样品溶液50倍稀释，用226nm波长在最佳优化实验条件下进行测定，仪器软件自动分析结果；

(3)铜离子检测酶联免疫试剂盒的组装铜离子残留与含量的酶联免疫试剂盒，标准配置包括最佳工作浓度的Cu2+mAb，最佳工作浓度的RaMIgG-HRP，底物显色剂A，底物显色剂B，Cu2+-ITCBE-OVA包被并封闭好的96孔或48孔酶标板，终止液，Cu2+标准品稀释液1～9，洗液PBST；洗液为0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺，终止液为2mol/L的硫酸溶液；

所述铜离子酶联免疫试剂盒操作步骤如下：

A1、样品前处理方法：用0.1mol/L EDTA溶液处理样品，离心取上清液用于检测；

A2、检测步骤：第一步除第一排最后两孔分别为阴性对照和空白对照外，每孔加入50μL工作浓度的Cu2+mAb，同时加入等体积铜离子标准液，其他孔根据检测要求加入50μL已处理的待检样品和等体积工作浓度的Cu2+mAb，混匀后37℃温育15min，反应后用PBST洗板；第二步每孔加入50μL工作浓度的RaMIgG-HRP，37℃温育25min，PBST洗板；第三步每孔加入100μL的酶底物A、B混合液显色，室温反应5min，每孔加入100μL终止液，用酶标仪读A450值，记录结果；

A3、分析检测结果：将获得的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算得出待测样品中铜离子的含量；

所述铜离子酶联免疫试剂盒标准曲线阻断ELISA测定单克隆抗体对不同浓度Cu2+标准品的抑制率，以抑制率B/B0％为纵坐标，其中B是Cu2+不同标准浓度的A450值，B0是Cu2+0μg/L的标准浓度的A450值，以不同标准品浓度的对数值为横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，推导回归方程，进行回归分析；线性的回归方程为y＝-36.235x+106.36，R2＝0.9524，IC50为35.64μg/L。

2.权利要求1所述的用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织样品中的铜离子含量的

2+

酶联免疫试剂盒在检测Cu 浓度中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其检测结果分析：将获得的OD值放入标准曲线的回归方程式中进行计算得出待测样品中Cu2+含量；线性的回归方程为y＝-36.235x+106.36，R2＝

0.9524，IC50为35.64μg/L；检测限为0.42μg/L，检测范围为2.83～456.04μg/L。