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专利号: 201310505662X
申请人: 常州大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法,其特征在于按照下述步骤进行:

(1)溶藻细菌LR5菌种活化培养:

溶藻细菌菌种活化即为挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中,取4 mL液体培养基,挑取一环菌进入液体培养基中,放于立式恒温振荡器,130 r/min,30℃培养到溶藻细菌

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LR5的对数期,10-10 个/ml;

(2)酶解去除溶藻细菌LR5细胞壁:

提取4 ml的活化后溶藻细菌LR5置于台式离心机中,设置离心转速4000 r/min,离心时间是10分钟,使用SMM缓冲液洗涤2至3次,使用1.60至1.95 mlSMM缓冲液将菌液混匀;添加0.05至1.00 mg/mL的溶菌酶0.05至0.40 ml和2 ml的质量浓度为0.4至1.2 g/L的EDTA溶液,设置水浴温度30至50℃条件下酶解15至75 min;待到酶解结束后,再使用台式离心机;离心转速4500 r/min,离心时间是15分钟;离心收集刚刚制得的溶藻细菌LR5原生质体,用32.14 g/L的高渗NaCl溶液洗涤菌体2至3次,将溶菌酶酶液去除后再用4 ml的32.14 g/L高渗NaCl溶液重悬;此即为制得的溶藻细菌LR5原生质体;

(3)溶藻细菌LR5原生质体再生:

提取高渗NaCl溶液重悬的溶藻细菌LR5原生质体悬浮液,用32.14 g/L 质量浓度的NaCl溶液稀释到合适的两个梯度,分别吸取200 μl菌体稀释液涂布于高渗固体培养基,其中每个梯度做两个平行样,放置于30℃恒温培养箱培养24至48 h,使得溶藻细菌LR5原生质体恢复其细胞壁,此即为溶藻细菌LR5原生质体再生。

2.根据权利要求1所述的一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法,其特征在于所述的溶藻菌LR5Pseudomonas aeruginosa,其保藏号为CGMCC NO.7517。

3.根据权利要求1所述的一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法,其特征在于上述的步骤(1)中所述的溶藻细菌LR5菌种活化操作中培养用的培养基成分展示如下:(1)普通细菌培养液:1L蒸馏水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠 5 g;其中要求调节pH为7.0至7.2;(2)普通细菌培养基:1L蒸馏水中添加牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、琼脂20至24 g、氯化钠 5 g;其中要求调节pH为7.0至7.2;此上所述的培养基据实验灭菌要求在高压灭菌锅中在121℃灭菌温度下持续灭菌20 min。

4.根据权利要求1所述的一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法,其特征在于所述的步骤(3)中所述的溶藻细菌LR5原生质体恢复细胞壁,即为原生质体再生使用用的高渗固体培养基成分展示如下:800 mL蒸馏水中添加蛋白胨 10 g、酵母浸出汁

5 g,、牛肉膏 5 g、琼脂20至24 g、蔗糖 170 g(0.5 mol/L);其中要求调节pH为7.0至

7.2;此上所述的培养基根据要求在高压灭菌锅中在121℃灭菌温度下持续灭菌20 min。

5.根据权利要求1所述的一种处理蓝藻的LR5溶藻细菌的原生质体制备与再生方法,其特征在于所述的配制溶液成分如下:(1)高渗氯化钠溶液:1 L蒸馏水中添加氯化钠

32.14 g;(2)SMM缓冲液:800 mL蒸馏水中添加蔗糖188.26 g、顺丁烯二酸2.3214 g、六水合氯化镁4.066 g;其中要求调节pH 6.8;(3)EDTA溶液:1 L SMM缓冲液中添加EDTA 0.6至1.2 g;(4)溶菌酶:1 mL SMM缓冲液中添加0.1 mg;上述配制的溶液根据实验要求要在高压灭菌锅中在121℃灭菌温度下持续灭菌20 min。