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专利号: 2013105971623
申请人: 华侨大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种雷公藤红素衍生物的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:

步骤一:取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支,置于25℃恒温培养箱中培养7天后,以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来,使单孢子悬液的浓度调整至

7 8

10 ~10 个/mL,既得种子孢子液;

步骤二:以100mL,5mL的接种量,在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液,在pH至

6.0,温度30℃±1℃,振荡速度为200r/min条件下培养12h后;按0.1~4ug的接种量,加入各种不同比例的联合诱导子,继续培养12h后,再按1~10ug的接种量加入雷公藤红素,然后继续培养5天,每天检测各种雷公藤红素衍生物的含量和转化率,当产物转化率低至0.5~3%时,停止培养,过滤后收集菌丝体,然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液;

步骤三:将步骤二所得提取液过滤,滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍,合并萃取液;

而菌丝体则用重量比为1:3~1:10的乙酸乙酯超声提取30min,然后滤去菌丝体,所得滤液与萃取液合并,既得分离提取液,提取液浓缩至干,得到提取后残渣;

步骤四:将经过步骤三处理所得的残渣,用1mg:1~10mL的比例用丙酮溶解后,采用硅胶拌样后挥干,称取20倍于样品量的硅胶,使用湿法进行填柱和上样;首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净,然后依次用体积比为:5:2,2:3,2:5,

0:5的石油醚:二氯甲烷的洗脱液,体积比为10:0,8:1,6:1,4:1,2:1,1:1,1:2,1:4,1:6,

1:8的二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液,以及100%乙酸乙酯洗脱液,依次对柱子进行洗脱,TLC控制收集主馏分,最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后,用适量色谱纯的甲醇溶解后,用0.22μm的有机膜过滤后,得到分离液;

步骤五:将经过步骤四处理所得的分离液,采用高效液相半制备法分离纯化,HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤红素衍生物洗脱液,减压蒸去溶剂后,用甲醇结晶后所得到的化合物,即为所述的雷公藤红素衍生物。

2.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法,其特征在于:所述土豆培养基为:土豆200g/L,葡萄糖20g/L;配置时将土豆去皮后将其切成小块,加水加热煮沸

30min,过滤,取滤液定容至1L,加入葡萄糖20g,搅拌溶解后,121℃灭菌30min,即得;

斜面培养基为:取上述土豆培养基1L,加入琼脂粉各20g,加热溶解后分装于玻璃试管中,于121℃下灭菌30min后取出,倾斜45度,静置、冷却既得。

3.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法,其特征在于:所述转化菌种为下述微生物中任意一种:短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana)AS3.970;AS3.153;AS3.910;AS3.

954,AS3.2016;AS3.2017;AS3.2018;AS3.3401;或者刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)AS3.154;AS3.952;AS3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1

978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS

3.2716;AS3.400;或者雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans.)AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS

3.2717;AS3.3402;AS3.2476;小克银汉霉CFCC5029;或者Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton,teleomorph ATCC9245;ATCC8688a;ATCC8983;

或 者 Cunninghamella echinulata(Thaxter)Thaxter var.echinulata,teleomorph ATCC11585a;ATCC36190;ATCC11585b;ATCC9244;或 者 Cunninghamella echinulata var.elegans(Lendner)Lunn et Shipton,teleomorph ATCC11064;ATCC10028a;或 者Cunninghamella elegans ATCC36112;ATCC26269;ATCC10028b;黑 曲 霉 Aspergillus niger AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;AS3.879;AS3.939;AS3.9

40;AS3.1858;AS3.2931;AS3.3882;AS3.3883;AS3.4303;AS3928;AS3.4304;AS3.4309;AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523;黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。

4.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法,其特征在于:所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成:A组:A1为α-环糊精,A2为β-环糊精,A3为2,6-二甲基-β-环糊精,A4为2-羟丙基-β-环糊精,A5为甲基化-β-环糊精、A6为羟乙基-β-环糊精,A7为葡萄糖-β-环糊精,A8为磺丁基-β-环糊精,A9为γ-环状糊精,A10为羧甲基-β-环糊精;

B组:B1为茉莉酸甲酯,B2为水杨酸,B3为壳聚糖,B4为茉莉酸,B5为真菌聚糖类,B6为β-葡聚糖,B7为谷胱甘肽,B8为2-羟乙基茉莉,B9为油菜素内酯,B10为云酯,B11为甲壳素;B12为小克银汉霉属AL4粗诱导子;

C组:C1为卡马西平,C2为莫达非尼,C3为奈韦拉平,C4为利福平,C5为贯叶连翘,C6为异烟肼,C7为胰岛素,C8为奥美拉唑,C9为苯巴比妥,C10为泼尼松,C11为泼尼松龙,C12为地塞米松,C13为倍他米松,C14为倍氯米松,C15为戊酸倍他米松,C16为醋酸地塞米松,C17为9-氟-16α-甲基11β,17-二羟基-3-氧-1,4-雄二烯-17β-羧酸。

5.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法,其特征在于:TLC控制收集主馏分,用体积比为70:12的氯仿和甲醇为展开剂;

所述产物转化率的高效液相色谱检测方法为:色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm,粒径为5μm;雷公藤红素检测波长:427nm,室温;进样量:10μL;

所述梯度洗脱法控制不同的雷公藤红素衍生物的高效液相色谱检测方法为:色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,其中分析柱内径乘以长度为4.6mm×250mm,粒径为

5μm;吸收波长:427nm;

流动相:甲醇:0.1%磷酸水的体积比和洗脱时间分别如下:27:73、洗脱时间0min;

5:95、洗脱时间20min;17:83、洗脱时间25min;27:73、洗脱时间28min,27:73、洗脱时间

30min;

上述对应的流速为:0.5ml/min;0.5ml/min;1ml/min;1ml/min;0.5ml/min;柱稳:

25℃、进样量:20μl。

6.如权利要求1~5任一项所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法,其特征在于:

所述方法可用于制备的雷公藤红素衍生物如下:二氢雷公藤红素,二氢扁塑藤素,二氢雷公藤酚B6,二氢tingenine B4,二氢雷公藤酸A、二氢雷公藤酸C、二氢pristimerol、雷公藤红素甲酯、雷公藤红素乙酯、雷公藤红素丙酯、雷公藤红素丁酯、雷公藤红素卞酯、14N-甲基-哌嗪酸-雷公藤红素酯、3-乙基雷公藤红素、3-丁基雷公藤红素、3-丙基雷公藤红素、

3-异丁基雷公藤红素、3-川芎嗪酸雷公藤红素、28--川芎嗪酸雷公藤红素、a-硫辛酸雷公藤红素酯、2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素,2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素甲酯,2,3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素丁酯,2,3,7羟基-6磺酸钠-雷公藤红素,2-羟基-3乙酰基-6磺酸钠-雷公藤红素,2,3羟基-6磺胺-雷公藤红素甲酯、28-(4’-甲氧基)-苄基酰胺雷公藤红素,28-苄基酰胺雷公藤红素,28-(3’-吡啶)甲酰胺基雷公藤红素,28-异丙基酰胺雷公藤红素、28-(N-甲基)-甲酰胺雷公藤红素,28-吡咯烷酰胺雷公藤红素、28-甲氧基乙基酰胺雷公藤红素、28-吗啉酰胺雷公藤红素、28-N-甲基酰胺雷公藤红素、雷公藤红素28-N-甲基哌嗪酰胺、雷公藤红素苯甲酸酯、雷公藤红素异丙酯等雷公藤红素衍生物。

7.一种雷公藤红素衍生物,所述雷公藤红素衍生物是利用权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法制得,其特征在于:所述雷公藤红素衍生物的结构式a如下:其中R1为氢、烷基、酰基或者有机酸根,且可以由烷氧基、烷基或者羟基取代,其中所述烷基或者烷氧基包括至多10个碳原子;所述酰基为带含有硫杂环、含氮杂环和含氧杂环的酰基;所述有机酸根为脂肪酸根或者芳香酸根;所述脂肪酸根为、乙酸根、丙酸根、丁酸根、丙二酸根、磺酸根、丙酮酸根、肉桂酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根、硫辛酸根、N-乙酰半胱氨酸或者氨基酸根;所述芳香酸根为苯甲酸根或者吡嗪酸根;其中,基团X1和X2可以为羟基或氢;结构中连接基团R1及基团X1和X2的“—”键可代表 或

8.如权利要求7所述的一种雷公藤红素衍生物,其特征在于:

当R1是甲基时,基团X1和X2中一个为羟基,一个为氢,或者均为羟基;

当R1是羟甲基时,基团X1和X2一个为羟基,一个为氢,或者均为羟基;

当R1是羧基时,基团X1和X2均为羟基,或者均为氢。

9.如权利要求7所述的一种雷公藤红素衍生物,其特征在于:

所述雷公藤红素衍生物具体为:6-羟基雷公藤红素、7-羟基雷公藤红素、6,7-二羟基雷公藤红素、23-羟基雷公藤红素、6,23-双羟基雷公藤红素、7,23-双羟基雷公藤红素、6,

7,23-三羟基雷公藤红素、6,7-二羟基-23-羧基-雷公藤红素、23-羧基雷公藤红素。

10.如权利要求7~9任一项所述的一种雷公藤红素衍生物可以用于治疗与肿瘤相关的疾病,包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病。

11.如权利要求7~9任一项所述的一种雷公藤红素衍生物可以用于治疗与病毒相关的疾病,包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。

12.如权利要求7~9任一项所述的一种雷公藤红素衍生物可以用于治疗与神经损伤相关的疾病,包括阿尔兹海默病、帕金森病、亨延顿氏退行性疾病和脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化疾病。

13.一种雷公藤红素衍生物,所述雷公藤红素衍生物是利用权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法制得,其特征在于:所述雷公藤红素衍生物的结构式b如下:其中R1′为氢或烷基,且可以由烷氧基、烷基或者羟基取代,其中所述烷基或者烷氧基包括至多2个碳原子;其中基团X1′和X2′可以为羟基、氢、酰基或者有机酸根;所述酰基为带含有硫杂环、含氮杂环和含氧杂环的酰基;所述有机酸根为脂肪酸根或者芳香酸根;

所述脂肪酸根为、乙酸根、丙酸根、丁酸根、丙二酸根、磺酸根、丙酮酸根、肉桂酸根、琥珀酸根、柠檬酸根、乳酸根、葡萄糖酸根、硫辛酸根、N-乙酰半胱氨酸或者氨基酸根;所述芳香酸根为苯甲酸根或者吡嗪酸根;结构式b中连接R1′及基团X1′和X2′的“—”键可代表或

14.如权利要求13所述的一种雷公藤红素衍生物,其特征在于:当R1′是氢时,基团X1′和X2′中,一个为羟基,一个为氢;或基团X1′和X2′均为羟基;

当R1′是羟基时,基团X1′和X2′中,一个为羟基,一个为氢;或基团X1′和X2′均为氢。

15.如权利要求13所述的一种雷公藤红素衍生物,其特征在于:所述雷公藤红素衍生物具体为:6-氢-7-羟基雷公藤红素、6-氢-23-羟基雷公藤红素、6-氢-7,23-二羟基雷公藤红素、6-氢-6,7-二羟基雷公藤红素、6,7,8-三氢-6,7-二羟基雷公藤红素、6-氢-6,

23-二羟基雷公藤红素。

16.如权利要求13~15任一项所述的一种雷公藤红素衍生物可以用于治疗与肿瘤相关的疾病,包括肺癌、肝癌、前列腺癌、人卵巢癌、腺癌、乳腺癌、粒细胞白血病、结肠癌、阿霉素敏感的肺癌、乳腺癌、肝癌、阿霉素抗药的肺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤系统疾病。

17.如权利要求13~15任一项所述的一种雷公藤红素衍生物可以用于治疗与病毒相关的疾病,包括艾滋病、乙肝、疱疹、流感病毒。

18.如权利要求13~15任一项所述的一种雷公藤红素衍生物可以用于治疗与神经损伤相关的疾病,包括阿尔兹海默病、帕金森病、亨延顿氏退行性疾病和脊髓损伤和肌萎缩性侧索硬化疾病。