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专利号: 2013106372643
申请人: 陕西科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-26
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)将纤维堆囊菌菌株摇瓶培养72-96h,将得到的摇瓶菌种液接种至一级种子罐中一级放大培养72-96h,将得到的一级菌种液接种至二级种子罐中二级放大培养72-96h,将得到的二级菌种液转入发酵罐中三级放大发酵培养12-96h后,得到发酵液;

步骤1)所述的摇瓶中的培养温度为30℃,转速为180~220rpm;所述的一级种子罐、二级种子罐及发酵罐中的培养温度为30℃,转速为150~200rpm,空气流量比为1:0.5,罐2

压为0.04~0.1kg/cm;

2)向发酵液中加入发酵液总体积1%~5%的大孔吸附树脂,转速调整至120~

150rpm,调节pH值至7.0~7.4后,继续培养100-150h后,停止发酵;所述的大孔吸附树脂为XAD-16型大孔吸附树脂;

3)收集步骤2)发酵结束后的液体中的大孔吸附树脂,用大孔吸附树脂3~5倍体积的乙酸乙酯进行洗脱18~32h,收集乙酸乙酯洗脱液,将乙酸乙酯洗脱液在40~45℃下,真空度为-0.09~-0.085MPa的条件下,真空浓缩至干,得到含有埃博霉素B的粗提物;

4)将含有埃博霉素B的粗提物用甲醇溶解后,离心,将上清液经葡聚糖凝胶柱层析进行分离,用HPLC进行检测,合并含有埃博霉素B的组分,得到埃博霉素B分离液;

所述的葡聚糖凝胶柱层析选用Sephadex LH-20层析柱,流动相选用甲醇,上样量为柱体积的1%~2%,流动相流速为8~12mL/min,展开距离为7.2~7.8cm/h;

5)向埃博霉素B分离液中加入该分离液总体积2%~5%的埃博霉素B分子印迹聚合物,摇床处理18~30h后,用甲醇进行洗脱,收集甲醇洗脱液;

6)将甲醇洗脱液浓缩后,得到浓缩液,将浓缩液低温结晶处理,析出的白色结晶即为埃博霉素B。

2.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤1)所述的摇瓶、一级种子罐和二级种子罐中所用的培养基均为M26液体培养基,成分为:土豆淀粉7.5~8.0g/L,大豆蛋白胨1.5~2.0g/L,葡萄糖1.5~2.0g/L,

3+

酵母粉1.5~2.0g/L,MgSO4·7H2O1.0~1.2g/L,CaCl2 1.0~1.2g/L,EDTA-Fe 1mL/L,微量元素1mL/L,pH值为7.2;

所述的发酵罐中的培养基成分为:土豆淀粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆饼粉1.7~2.0g/L,MgSO4·7H2O 2.3~2.5g/L,CaCl23.0~3.5g/L,

3+

EDTA-Fe 2mL/L,微量元素0.5~1.0mL/L,pH值为7.2。

3.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤2)所述的大孔吸附树脂在使用前经过预处理,包括:先用3~5倍柱体积的甲醇浸泡大孔吸附树脂,摇床震荡12~24h后,去除甲醇,水洗至无醇味,再用甲醇浸泡

12~24h后,水洗至无醇味,备用。

4.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤4)所述的离心是在15~25℃下,5000~10000rpm,离心10~20min。

5.根据权利要求1所述的一种从纤维堆囊菌发酵液中分离提取埃博霉素B的方法,其特征在于,步骤6)所述的浓缩是将甲醇洗脱液在40~45℃下,真空度为-0.09~-0.085MPa的条件下,真空浓缩至甲醇洗脱液体积的1/10;所述的低温结晶处理是将浓缩液在-20~-15℃下低温处理至析出白色结晶。