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专利号: 2013107222751
申请人: 安徽师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 测量;测试
更新日期:2023-12-08
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法,步骤包括:

a、制备特定粒径纳米金粒子的免疫原;

b、将免疫原注射到动物体内,制得高特异性抗体;

c、用吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量,将抗抗体酶标记制得酶标二抗体,用间接竞争酶联免疫法将标准样品与待测样竞争与抗体的反应,酶标二抗体的酶促使底物液发光,测得吸光度值,通过标准曲线求得待测样浓度。

2.如权利要求1所述的测试方法,其特征在于:

所述步骤a中特定粒径纳米金粒子的免疫原的制备方法为:

在搅拌下将巯基乙酸溶液加入到特定粒径纳米金粒子溶液中,在搅拌15-20min后调节溶液在弱酸条件下,分别加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液,室温避光下搅拌3-4h,然后再调节pH9~10,加入牛血清白蛋白,4℃下搅拌5-6h后,将反应液装入透析袋,用蒸馏水透析12h以上,避光低温保存。

3.如权利要求2所述的测试方法,其特征在于:所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L,特定粒径纳米金粒子溶液浓度为0.4~0.6μg/mL,1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液浓度为0.2mol/L,N-羟基琥珀酰亚胺溶液浓度为0.05mol/L,牛血清白蛋白浓度为10mg/mL,巯基乙酸、1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比1:4:2;纳米金粒子、巯基乙酸和牛血清白蛋白的质量比为1:1:2000。

4.如权利要求1所述的测试方法,其特征在于:所述步骤b中高特异性抗体的制备方法为:将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对动物进行多次免疫,制得特定粒径纳米金粒子高特异性抗体。

5.如权利要求4所述的测试方法,其特征在于:所述多次免疫方法为:第一次动物免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶,免疫剂量1mL,免疫部位为背部皮下多点注射,免疫三周后,进行五次加强免疫,加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶,免疫剂量1mL,免疫部位为背部皮下多点注射,五次加强免疫免疫间隔为两周,经五次加强免疫后,从动物心脏采血,血清室温20-25℃静置0.5-1h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清,制得高特异性抗体。

6.如权利要求1所述的测试方法,其特征在于:所述步骤c中吸光度法具体为:包被:在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原,100μL/孔,8组,每组3孔,37℃温育

1-3h,或4°过夜12h,PBST洗涤3次;所述包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法,不同处在于使用鸡卵白蛋白代替牛血清白蛋白;

封闭:加10mg/mL的OVA溶液,200μl/孔,37℃温育15-60min,PBST洗涤3次;

竞争:加入50μl/孔不同浓度特定粒径纳米金粒子溶液,加入浓度为30μg/mL抗体,

50μl/孔,37℃温育2-4h,PBST洗涤3次;

加酶:加入100μl/孔稀释度为1:500酶标二抗体溶液,37℃温育2-4h,PBST洗涤3次;

显色:加入底物液100μL/孔,37℃温育温育15-60min;底物液处理方法为:在加处理后的底物液前15-30min向底物液原液加入OPD,加入量为10mL底物液原液中加入4mg OPD,加处理后的底物液前3-5min向底物液原液加入质量分数为30%的H2O2,加入量为底物液原液体积分数的0.15%;

检测:加入终止液50μL/孔,测定吸光度值,绘制标准曲线;

将待测样用同样方法测定吸光度值,通过标准曲线求得待测样浓度。