1.一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，金黄色葡萄球菌肠毒素D缩写为SED，其特征在于：酶标板上包被了包被抗体5F2，即CGMCC No.7212，合适的浓度下可以最大限度捕获SED；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体10F1-HRP，即CGMCC No.7213-HRP，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色15min；

样品中SED浓度≥0.02ng/mL，那么样品中SED被包被抗体捕获并与酶标抗体

10F1-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性；

样品中SED浓度＜0.02ng/mL，那么样品中SED不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性；

（1）SED单克隆抗体的制备

以北京军事医学科学院提供的重组表达的SED为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个细胞株；

（2）单克隆抗体的配对筛选

将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为0.01M、pH9.6的碳酸盐缓冲液；

标品浓度30ng/mL标品稀释液0.01M、pH7.2 的PBS；酶标抗体稀释800倍使用；在此条件下，实验成功得到了11对P/N值>10的配对；

（3）夹心法的建立

选择检测限最稳定的配对，即以5F2为包被抗体，以10F1作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：抗体包被浓度：1μg/mL，

包被液：0.01M、pH9.6碳酸盐缓冲液，标品稀释液：0.01M、pH7.2 的PBS，检测抗体浓度：1μg/mL，

反应时间：包被、封闭37℃，2h；标准品，37℃，1h；检测抗体37℃，1h；显色15min；

优化后SED夹心法，LOD：0.006ng/mL，检测限0.02ng/mL。

2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，其特征在于：测定步骤为：a、包被:用1μg/mL的5F2包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜；

b、洗涤:用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL /孔，然后甩干反应板，所述PBST为含0.05%吐温-20的PBS；

c、封闭:含0.2%明胶的CBS，200μL /孔，37℃封闭2h；

d、洗涤:同b；

e、样品:用PBS将SED母液稀释成0.01953，0.03976，0.07812，0.1563，0.3125，0.625，

1.25，2.5ng/mL系列浓度，另设一个PBS空白对照，每孔加入100μL样品，于37℃温育1h；

f、洗涤：同b；

g、加1μg/mL的酶标抗体10F1-HRP，100μL /孔，37℃反应1h；

h、洗涤：同b；

i、显色：加显色液 100μL /孔，显色15min；

显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用；

显色液A：0.933 g柠檬酸，3.68 g Na2HPO4·12H2O，18 μL 30%H2O2，100mL水；

显色液B：60 mg四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇；

j、终止：加2 mol/L硫酸终止液50μL /孔；

k、测定：用酶标仪检测OD450nm，绘制SED双抗体夹心法的标准曲线，样品测定时从该标准曲线上OD450nm值对应求得样品中SED含量。