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专利号: 2014100765874
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种以酪氨酸为底物合成圣草酚的大肠杆菌基因工程菌,其特征在于,在大肠杆菌内构建了由酪氨酸合成柚皮素的途径,并融合表达了截去膜结合序列的黄酮3’羟化酶基因tF3’H和P450还原酶基因tCPR以实现由柚皮素向圣草酚转化的途径;

敲除了大肠杆菌基因组乙酸激酶ackA基因,过表达了乙酰辅酶A合成酶基因和乙酰辅酶A羧化酶基因以强化丙二酰辅酶A途径;

所述tF3’H和tCPR的融合基因tF3’H-tCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,是截去膜结合序列的源于非洲菊(Gerbera hybrid)的黄酮3’羟化酶基因tF3’H和长春花(Catharanthus roseus)的P450还原酶基因tCPR的融合基因;

所述tF3’H-tCPR基因通过克隆于pACYCDuet-1,得到重组质粒pACYC-tF3’H-tCPR,然后转化大肠杆菌进行表达;

通过表达来自粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶基因tal,来自欧芹(Petroselinum crispum)的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl,来自矮牵牛(PetuniaXhybrid)的査尔酮合成酶基因CHS以及来自紫苜蓿(Medicago sativa)的查尔酮异构酶基因chi,实现酪氨酸合成柚皮素的途径;编码所述tal、4cl的基因通过克隆到载体pCDFDuet-1,得到pCDF-TAL-4CL,编码所述CHS和chi的基因通过克隆到载体pETDuet-1,得到pET-CHS-CHI。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌基因工程菌,其特征在于,乙酰辅酶A合成酶基因acs来自E.coli BL21(DE3)基因组,乙酰辅酶A羧化酶基因acc来自谷氨酸棒杆菌。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌基因工程菌,其特征在于,所述乙酰辅酶A羧化酶基因acc包括accBC和dtsR1两个基因,所述基因acs、accBC和dtsR1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示,它们通过克隆到载体pRSFDuet-1,得到重组表达载体pRSF-acs-ACC,然后转化大肠杆菌进行表达。

4.一种构建权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌的方法,其特征在于,主要步骤如下:

(1)合成融合基因tF3’H-tCPR,连接载体pACYCDuet-1,得到重组表达载体pACYC-tF3’H-tCPR;

(2)敲除E.coli的乙酸激酶ackA基因,强化丙二酰辅酶A途径;

(3)将编码乙酰辅酶A合成酶的基因和乙酰辅酶A羧化酶的基因克隆到载体pRSFDuet-

1,构建重组表达载体pRSF-acs-ACC;

(4)将编码酪氨酸解氨酶的基因tal、4-香豆酸:辅酶A连接酶的基因4cl克隆到pCDFDuet-1构建重组表达载体pCDF-TAL-4CL,将编码査尔酮合成酶的基因chs以及查尔酮异构酶基因chi克隆到载体pET Duet-1构建重组表达载体pET-CHS-CHI;

(5)将重组表达载体pACYC-tF3’H-tCPR、pRSF-acs-ACC、pCDF-TAL-4CL和pET-CHS-CHI一起转化敲除了乙酸激酶ackA基因的E.coli BL21(DE3)。

5.一种应用权利要求1所述大肠杆菌基因工程菌生产圣草酚的方法,其特征在于,是将工程菌株在25mL LB培养基中,于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养,然后以2%接种量转接到25mL发酵MOPS培养基中37℃培养,待菌种生长至OD600=1.2-1.8时,添加新鲜的

25mL发酵MOPS培养基和终浓度为0.6mM的IPTG诱导以及1mM的L-酪氨酸为底物,转至25℃低温诱导培养48h。