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专利号: 2014102182517
申请人: 浙江海洋学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-07-25
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种大黄鱼鱼鳔蛋白降压肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

1)大黄鱼鱼鳔洗净、破碎匀浆,按料液比1g:8~10 ml的比例加入浓度0.2mol/L,pH 

7.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液,于 0~4 ℃下振荡抽提24~48 h,以8000~12000rpm的转速离心15~25 min,得上清液;上清液中加入硫酸铵,使硫酸铵浓度达到30%,静置1~3 h后,以8000~12000rpm的转速离心15~25 min,去除沉淀物,上清液中继续加入硫酸铵,使其浓度达到60%,静置1~3 h后,以8000~12000rpm的转速离心15~25 min,得沉淀物,并置于透析袋中用蒸馏水透析18~24 h,透析液冷冻干燥,得鱼鳔粗蛋白;

2)取鱼鳔粗蛋白,按照料液比1 g:15 20 mL加入双蒸水,调节pH 值至7.5 8.0,于35~ ~ ~

40℃保温10 15 min;按照鱼鳔湿重的1.0 1.5%加入第一种蛋白酶,于35 40℃温度下酶解3~ ~ ~

5 h;酶解液调pH 值至9.0 10.0,于40 50℃保温10 15 min;按照鱼鳔湿重的1.0 1.5%加~ ~ ~ ~ ~入第二种蛋白酶,于40 50℃温度下酶解2 4 h;

~ ~

3)将酶解液加热到90 95℃灭活10 15 min,4500 5000 rpm离心15 20 min,取上清液;

~ ~ ~ ~

上清液依次经超滤和层析,得到降压肽;该降压肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile(SEQ ID No:1),分子量为497.65 Da;

所述步骤2)中的第一种蛋白酶为胰蛋白酶,酶活力≥1.85×105 U/g;

所述步骤2)中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶,酶活力≥1.90×105 U/g。

2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于所述步骤3)的超滤和层析的具体过程为:超滤:将上清液调至pH 6.5 7.5,于0.10   0.15 MPa的工作压力和25 30℃的工作温~ ~ ~度下采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于1 kDa部分,得超滤酶解物;

层析:将上述超滤酶解物用双蒸水配成10 15 mg/mL的溶液,经过大孔树脂分离,用双~蒸水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和90%乙醇梯度洗脱,分别收集相应梯度的洗脱溶液,干燥,得四个组分,其中,ACE抑制活最强组分为大孔树脂纯化酶解物;将上述大孔树脂酶解物用双蒸水配成10 15 mg/mL的溶液,经过凝胶柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据220 nm~下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,ACE抑制活最强组分为凝胶层析酶解物,将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80 100 μg/mL的溶液,利用反相高效液相色谱进行纯化,根据ACE~抑制活性得1个高活性降压肽Leu-Arg-Pro-Ile(SEQ ID No:1)。

3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述大孔树脂为DA 201-C,所述凝胶为葡聚糖凝胶Sephadex LH-20;所述RP-HPLC条件为:进样量15 20 μL;色谱柱为Waters ~Spherisorb ODS-2 C18;柱温为25 30 ℃;流动相:A含0.1%三氟乙酸的水和B乙腈;梯度洗~脱:0 10 min乙腈浓度为10%;11 40 min乙腈浓度从10匀速升至60%;洗脱速度0.8 1.0 mL/~ ~ ~min;紫外检测波长220 nm。

4.一种权利要求1中所述的大黄鱼鱼鳔降压肽的应用,其特征在于Leu-Arg-Pro-Ile(SEQ ID No:1)用于制备保健食品的用途。