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专利号: 2014103058023
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种冬虫夏草3-异丙基苹果酸脱氢酶B,其特征在于所述脱氢酶B的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的冬虫夏草3-异丙基苹果酸脱氢酶B在生物催化3-异丙基苹果酸制备4-甲基-2-氧代戊酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述的应用为:以冬虫夏草含3-异丙基苹果酸脱氢酶B重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮,超声破碎后,将破碎混合液离心,取上清液为催化剂,以3-异丙基苹果酸水溶液为底物,以辅酶Ⅰ为辅助底物,于Tris-HCl缓冲液中,37℃、150rpm条件下反应,反应结束后,将反应液离心,取上清液即获得含4-甲基-2-氧代戊酸的混合液,将混合液分离纯化,获得4-甲基-2-氧代戊酸。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于:所述底物3-异丙基苹果酸水溶液浓度为

0.1M,所述反应体系中底物的初始浓度为0.02M,所述催化剂的体积用量以超声破碎前湿菌体质量计为0.01g/L,所述辅酶Ⅰ的终浓度为10g/L。

5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述催化剂按如下方法制备:将含3-异丙基苹果酸脱氢酶B的重组工程菌接种于含终浓度50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中,

37℃、250r/min培养过夜,取培养物,以体积浓度2%的接种量转接于含有终浓度50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基中,37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6~0.8,向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h,收集湿菌体,将湿菌体在功率40%、破1s停1s条件下超声破碎,取细胞破碎混合液离心,取上清液即为催化剂。

6.一种编码权利要求1所述3-异丙基苹果酸脱氢酶B的基因。

7.如权利要求6所述的编码基因,其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

8.如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化3-异丙基苹果酸制备4-甲基-2-氧代戊酸的基因工程菌中的应用。

9.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述的应用为:构建含有所述3-异丙基苹果酸脱氢酶B基因的重组载体,将所述重组载体转化至大肠杆菌中,获得的重组基因工程菌进行诱导培养,培养液分离纯化获得含有3-异丙基苹果酸脱氢酶B基因的菌体细胞。