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专利号: 2014103647704
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1. 一种应用固定化苯丙氨酸脱氨酶生产D-苯丙氨酸的方法,其特征在于,以DL-苯丙氨 酸溶液为底物,将固定化苯丙氨酸脱氨酶填装入固定床得到固定床酶反应器,催化L-苯丙 氨酸脱氨生成反式肉桂酸,得到高光学纯的D-苯丙氨酸;所述固定化苯丙氨酸脱氨酶通过 以下步骤获得:(1 )MCM-41载体的修饰:以介孔二氧化硅MCM-41为载体,将氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羟基上得到MCM-41 -NH2,提供共价固定的锚定位点;(2)制备MCM-41-NH-GA:取适量的载体如1-41-順2与0.5 %戊二醛在室温下反应lh,然后用双蒸水洗涤,洗去多 余的戊二醛,室温下干燥,制备成MCM-41-NH-GA; (3)固定化酶:取适量的MCM-41-NH-GA与酶 溶液进行混合,在室温下反应2h,获得共价固定化酶。

2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述固定床酶反应器是由固定化苯丙氨酸 脱氨酶与硅藻土混匀后填充玻璃柱得到。

3. 根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述固定床酶反应器是将100-200个酶活 单位的固定化苯丙氨酸脱氨酶与100-120g的娃藻土充分混合,装进径高比为5:1,体积为 450mL的玻璃柱中,固定床酶反应器的温度以循环夹套控制。

4. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)具体是将lg MCM-41、50mL无 水甲苯、2mL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷180°C回流12h后用无水甲醇洗涤三次,真空干燥后 获得修饰的载体MCM-41-NH2;所述步骤(2)取lg MCM-41-NH2载体与0.5%戊二醛在室温下反 应lh,然后用双蒸水洗涤三次,洗去多余的戊二醛,室温下干燥,制成MCM-41-NH-GA。

5. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤⑶取1 g MCM-41-NH-GA与50mg的 酶活性为3_5U/mg的酶溶液进行混合,在室温下反应2h,获得共价固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL〇

6. 根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于,所述催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式 肉桂酸包括以下步骤:以12mL/min的流速往固定床酶反应器中栗入100mM的DL-苯丙氨酸, 温度控制在50 °C,当流出的反应液中L-苯丙氨酸转化率达到80 %时,调整反应液的pH至5, 沉淀产物肉桂酸后再调整至初始PH8.5,将反应液栗入反应器继续反应,直至流出的反应液 中D-苯丙氨酸的光学纯度超过99 %时,反应结束。

7. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述苯丙氨酸脱氨酶是将苯丙氨酸脱氨酶 在大肠杆菌中进行表达后获得的。

8. 根据权利要求7所述的方法,其特征在于,将SEQ ID N0.1所示的基因以pET-28a( + ) 为表达载体,在E. co 1 i BL21中进行表达得到苯丙氨酸脱氨酶。

9. 根据权利要求8所述的方法,其特征在于,还包括对酶进行纯化:(1)收集重组菌,破 碎菌体后,离心取上清,上清液中加入硫酸铵粉末,至饱和度为35%,缓慢搅拌使其完全溶 解;(2)调节pH值使酶液的pH保持在8.7,静置半小时后低温离心收集上清液,继续加入硫酸 铵至饱和度为55 %,4°C静置数小时后,低温离心收集蛋白沉淀;(3)将沉淀溶解在25mM Tris-HCl pH 8.7的缓冲液中并且4°(:透析数小时。