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专利号: 2014104044668
申请人: 陕西科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种多形汉逊酵母突变菌株,其特征在于:该突变菌株为酸性磷酸酯酶基因突变菌株,酸性磷酸酯酶基因突变导致突变菌株的酸性磷酸酯酶活性消失。

2.根据权利要求1所述一种多形汉逊酵母突变菌株,其特征在于:所述突变菌株为敲除了酸性磷酸酯酶基因的多形汉逊酵母DL-1。

3.一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法,其特征在于:包括以下步骤:

1)利用基因敲除方法构建一株多形汉逊酵母酸性磷酸酯酶基因突变菌株,该突变菌株的酸性磷酸酯酶活性消失;

2)采用葡萄糖分批补料发酵的方法,利用所述突变菌株生物转化生产D-阿拉伯糖醇。

4.根据权利要求3所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法,其特征在于:所述步骤1)具体包括以下步骤:a)构建基因敲除质粒pMD18-PHO-kanMX,pMD18-PHO-kanMX的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示,以pMD18-PHO-kanMX为模板,并分别采用PHO-L-U和pUG6-D组成的引物对以及pUG6-U和PHO-R-D组成的引物对,利用PCR方法扩增酸性磷酸酯酶基因敲除片段,PHO-L-U的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示,pUG6-D的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示,pUG6-U的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示,PHO-R-D的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示,将所述敲除片段采用电穿孔法转化多形汉逊酵母DL-1;

b)利用高磷培养基显色筛选法从转化后的多形汉逊酵母DL-1中获得初筛菌株,然后以初筛菌株基因组为模板,并分别采用PHO-Y-U和pUG6-D组成的引物对以及pUG6-U和PHO-Y-D组成的引物对,利用PCR方法筛选突变菌株,当采用PHO-Y-U和pUG6-D组成的引物对以及pUG6-U和PHO-Y-D组成的引物对均扩增出片段时,所对应的初筛菌株为突变菌株,PHO-Y-U的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示,PHO-Y-D的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示。

5.根据权利要求4所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法,其特征在于:

所述高磷培养基的组成包括5g/L的硫酸铵、100g/L的葡萄糖、0.5g/L的硫酸镁,0.1g/L的氯化钙、500μg/L的硼酸、40μg/L的硫酸铜,100μg/L的碘化钾,200μg/L的氯化铁,

400μg/L的硫酸锰、200μg/L的钼酸铵、400μg/L的硫酸锌、500mg/L的磷酸二氢钾以及

15g/L的琼脂;高磷培养基显色筛选的显色剂的制备方法为:将α-萘酚磷酸盐、固蓝盐B和琼脂溶解于0.05mol/L醋酸水溶液中得混合物,混合物中α-萘酚磷酸盐的浓度为5mg/mL,固蓝盐B的浓度为50mg/mL,琼脂的浓度为10mg/mL,依据高磷培养基上菌落颜色变化,挑选出白色菌落,得初筛菌株。

6.根据权利要求3所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法,其特征在于:所述步骤2)具体包括以下步骤:种子培养:将突变菌株接种于种子培养基中并于28~37℃以及100~200r/min条件下培养14~24h得种子液;

发酵培养:将种子液接种于发酵培养基中并于28~37℃以及100~200r/min条件下连续培养,发酵培养基含有生物转化的底物葡萄糖,连续培养期间分批补加葡萄糖。

7.根据权利要求6所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法,其特征在于:所述种子培养基的组成包括4~10g/L的酵母浸粉、10~20g/L的葡萄糖以及10~20g/L的蛋白胨。

8.根据权利要求6所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法,其特征在于:所述发酵培养基的组成包括5~10g/L的酵母浸粉、10~20g/L的葡萄糖、10~20g/L的蛋白胨,0.5~2.5g/L的硫酸镁,1~3g/L的磷酸二氢钾,0.1~0.5g/L的氯化钙以及0.75~

3.75g/L的硫酸铵,种子液接种于发酵培养基后连续培养96~144h,连续培养期间每隔

24~28h补加50~60g/L的葡萄糖。

9.根据权利要求8所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法,其特征在于:所述发酵培养基的组成包括10g/L的酵母浸粉、20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨,2.0g/L的硫酸镁,1.5g/L的磷酸二氢钾,0.3g/L的氯化钙以及2.35g/L的硫酸铵。

10.根据权利要求8所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法,其特征在于:

所述分批补加葡萄糖的具体步骤为:种子液接种于发酵培养基后于37℃以及160r/min下培养24h,然后加入50g/L的葡萄糖,然后继续在37℃以及160r/min下培养并每隔24h加入50g/L的葡萄糖。