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专利号: 2014104386190
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶D478N,其特征在于:将来源于Alicyclobacillus hesperidum的L-阿拉伯糖异构酶进行突变得到单突变体酶;即将原来Alhe-LAI酶基因中的478位天冬氨酸Asp替换为天冬酰胺Asn,获得单突变体酶,命名为D478N,其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.权利要求1所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶D478N的制备方法,其特征在于步骤为:(1)在Alicyclobacillus hesperidum 的Alhe-LAI酶模拟结构的基础上确定突变位点;

(2)设计定点突变的突变引物,以携带Alhe-LAI酶基因的载体pET-22b(+)-Alhe-LAI为模板进行定点突变构建突变质粒pET-22b(+)-D478N;

突变引物如下所示,下划线为突变点:

上游外侧引物:5’-TTATCCATAT GGAGGATGCA AACATGCAT-3’,下游外侧引物:5’-TATATCTCGA GCCGATAACA CACTTCATT-3’,正向突变引物:5’- GTGATCAATC AGACGACGAA TCC-3’,下划线为突变碱基,反向突变引物:5’-TCGTCTGATT GATCACGATG C - 3’,下划线为突变碱基;

(3)将突变质粒pET-22b(+)-D478N转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养;

(4)离心菌体,重悬后超声破碎,阴离子交换柱纯化得到突变体酶D478N。

3.根据权利要求2所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶D478N的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述突变质粒pET-22b(+)-D478N含有Alhe-LAI的突变体酶D478N基因。

4.权利要求1所述催化活性提高且最适pH降低的L-阿拉伯糖异构酶Alhe-LAI的突变体酶D478N的应用,其特征在于:应用于化学、食品和制药领域,最适反应pH为6.0,使得底物D-半乳糖的平衡转化率提高。