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专利号: 2014106069138
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法,其特征在于,以甲醇诱导的醇氧化酶启动子启动GOD表达,在诱导产酶阶段分时段控制不同甲醇浓度,当菌体浓度达到90-100.0g/L,开始流加诱导培养基诱导产酶,诱导期前期,醇氧化酶活性升高并趋于平稳,控制发酵体系中残余甲醇浓度17.0-18.0g/L,诱导期中后期,醇氧化酶开始活性下降,控制发酵体系中残余甲醇浓度11.0-12.0g/L。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当菌体浓度达到90-100.0g/L,开始流加诱导培养基诱导产酶,诱导期0-60h时,控制发酵体系中残余甲醇浓度17.0-18.0g/L,诱导

60h后将发酵体系中的甲醇浓度降至11.0-12.0g/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,当菌体浓度培养达到100.0g/L,开始流加诱导培养基诱导产酶,诱导期0-60h时,控制发酵体系中残余甲醇浓度18.0g/L,诱导

60h后将发酵体系中的甲醇浓度降至12.0g/L。

4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,基本发酵培养基每1L含有:胰蛋白胨20g,酵母抽提物10g,甘油10mL,YNB13.4g,100mM pH6.0的磷酸缓冲液。

5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,诱导培养基每1L含有:胰蛋白胨20g,酵母抽提物10g,甲醇8mL,YNB13.4g,100mMpH6.0的磷酸缓冲液。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在诱导产酶期分时段控制甲醇诱导浓度的同时,流加甘露醇,甘露醇:甲醇的质量比为1:10~40。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,甘露醇:甲醇的质量比为1:20。

8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述毕赤酵母还共表达了毕赤酵母GCN4基因。

9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,将黑曲霉GOD基因连接载体pPIC9K,转化Pichia pastoris GS115,得到工程菌株PP-GOD;将毕赤酵母中GCN4基因克隆连接到去除了pGAPZαA的α-mating信号肽的载体pGAPZ,转化入工程菌株PP-GOD,与GOD共表达,得到工程菌株PP-G-GCN4,用于高密度发酵产GOD。

10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将种子菌液接入3L全自动发酵罐中,装液量800-1000mL,初始搅拌转速为500r/min,通气量2.5vvm,以30%的磷酸溶液和25%的浓氨水控制pH为5.5,生长期的培养温度为30℃,采用搅拌关联的DO-stat控制,维持DO在

30%,搅拌转速最高值设置为950r/min;当甘油耗尽时,DO>60%时,开始指数流加50%的甘油培养基,待菌浓接近100g/L,停止流加,待甘油耗尽,DO再次反弹,当DO>60%,开始诱导,将诱导温度降低至22℃,开始流加诱导培养基,使发酵体系中甲醇浓度达到目标浓度。