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专利号: 2014106998789
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种高产L-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建方法,其特征为:分别按照如下实验方案将avtA进行基因敲除和对乙酰羟酸合酶(AHAS)进行弱化,最后获得重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a ∆SS ∆avtA ∆C-T ilvN:(1)基因扩增:根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息,设计引物以谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a ∆SS基因组DNA为模板,分别扩增目的基因上游序列和下游片段,通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段,再将该片段连接至pMD19-T,对目的基因序列进行测序验证,确证重组克隆质粒序列的准确性;

(2)重组敲除质粒的构建:将所述步骤(1)中的连接有目的片段进行双酶切处理,将目的片段连接至相同双酶切处理的质粒pK18mobsacB,转化至E.coli JM109感受态细胞,筛选验证阳性克隆;

(3)基因的重组整合:提取步骤(2)构建的用于目的基因整合修饰的重组质粒pK18mobsacB-geneX,电激转化至谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a ∆SS及其系列衍生菌株感受态细胞,通过两次筛选获得成功敲除目的基因的重组菌株;

(4)重组菌株的验证:利用引物通过PCR扩增验证重组菌株; 重复上述实验即可获得了重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062-33a ∆SS ∆avtA ∆C-T ilvN。

2.一种高产L-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的发酵方法,其特征为:权利要求1获得的重组菌株在接种至含有2 g/L的玉米浆的发酵培养基中发酵培养96 h,定时取样检测生物量,糖浓度和氨基酸浓度;所述的发酵培养基为: 蔗糖 100;硫酸铵 30;碳酸钙 60;

MgSO4·7H2O 0.5;FeSO4·7H2O 0.02; MnSO4·H2O 0.02,单位g/L; 原儿茶酸 30 mg; 生物素 50μg; 硫胺素450μg; 调节初始pH为 7.2。