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专利号: 2014106998789
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种高产L-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建方法,其特征为:分别按照如下实验方案将avtA进行基因敲除和对乙酰羟酸合酶(AHAS)进行弱化,最后获得重组谷氨酸棒杆菌

33a△SS△avtA△C-T ilvN,所述的对乙酰羟酸合酶(AHAS)进行弱化,指的是敲除乙酰羟酸合酶的编码调控基因ilvN的C末端249bp;

(1)基因扩增:根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息,设计引物以谷氨酸棒杆菌33a△SS基因组DNA为模板,分别扩增目的基因上游序列和下游片段,通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段,再将该片段连接至pMD19-T,对目的基因序列进行测序验证,确证重组克隆质粒序列的准确性;

(2)重组敲除质粒的构建:将所述步骤(1)中的连接有目的片段的重组克隆质粒进行双酶切处理,将目的片段连接至相同双酶切处理的质粒pK18mobsacB,转化至E.coli JM109感受态细胞,筛选验证阳性克隆;

(3)基因的重组整合:提取步骤(2)构建的用于目的基因整合修饰的重组质粒pK18mobsacB△avtA电激转化至谷氨酸棒杆菌33a△SS感受态细胞,提取重组质粒pK18mobsacB△C-T ilvN电激转化至33a△SS△avtA感受态细胞,通过两次筛选获得成功敲除目的基因的重组菌株;

(4)重组菌株的验证:利用引物通过PCR扩增验证重组菌株;重复上述实验即可获得重组谷氨酸棒杆菌33a△SS△avtA△C-T ilvN。

2.一种如权利要求1所述的高产L-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的发酵方法,其特征为:权利要求1获得的重组菌株接种至含有2g/L的玉米浆的发酵培养基中发酵培养96h,定时取样检测生物量,糖浓度和氨基酸浓度;所述的发酵培养基为:蔗糖100g/L;硫酸铵30g/L,碳酸钙60g/L;MgSO4·7H2O 0.5g/L;FeSO4·7H2O 0.02g/L;MnSO4·H2O 0.02g/L;原儿茶酸30mg;

生物素50μg;硫胺素450μg;调节初始pH为7.2。