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专利号: 2014107080986
申请人: 陕西科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-23
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)将土壤加入到离心管中,并加入氢氧化钙水溶液,振荡使土样分散,得到土壤混合液;其中,土壤与氢氧化钙水溶液中氢氧化钙的比为(5-10)g:(10-20)mmol;

(2)向土壤混合液中加入磷酸盐溶液和氢氧化钠溶液,振荡使土壤中的细胞释放,然后进行离心,收集沉淀;其中,土壤与磷酸盐溶液中磷酸盐、氢氧化钠溶液中氢氧化钠的比为(5-10)g:(0.1-0.25)mmol:(0.1-0.25)mmol;

(3)向沉淀中加入DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液,然后于60-70℃下加热后得到溶液A;其中,沉淀、DNA提取液、溶菌酶溶液和蛋白酶k溶液的加入量比为(0.5-1.5)g:(500-1500)μL:(30-90)μL:(20-60)μL;

(4)向溶液A中加入氯仿与异戊醇的混合物,震荡至溶液变成乳浊液后进行离心,吸取上清液;其中,氯仿与异戊醇的混合物的体积是溶液A体积的0.8-1.2倍;

(5)向上清液中加入乙醇水溶液并进行离心,将所得沉淀晾干或烘干,得到DNA粗提物,将DNA粗提物进行纯化,得到基因组DNA。

2.根据权利要求书所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述将DNA粗提物进行纯化的具体过程为:将DNA粗提物溶解于无菌水中,然后加入洗涤液并进行离心,吸取上清液A;向上清液A中加入氯仿与异戊醇的混合物,震荡混匀,并于4℃下离心,吸取上清液B,向上清液B中加入乙醇溶液,并于4℃下离心,所得沉淀即为基因组DNA;其中,氯仿与异戊醇的混合物的体积为上清液体积的0.8-1.2倍;氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

3.根据权利要求2所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述洗涤液为BaCl2和CaCl2的水溶液,且水溶液中BaCl2与CaCl2的总浓度为0.5-1mol/L,且BaCl2与CaCl2的摩尔比为1:1、2:1或1:2。

4.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述步骤(1)中Ca(OH)2水溶液的浓度为1-2mol/L;振荡的时间为2-5min。

5.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述步骤(2)中磷酸盐水溶液和氢氧化钠溶液的浓度均为0.1-0.2mol/L;磷酸盐为磷酸钠或磷酸钾;步骤(1)中振荡的时间为5-10min。

6.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述步骤(3)中DNA提取液包括10mmol/L pH值为7.5的Tris-HCl,10mmol/L EDTA,100mmol/L NaCl,质量分数为5%的SDS;溶菌酶溶液的浓度为40-60mg/mL,蛋白酶k溶液的浓度为20-30mg/mL。

7.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述步骤(3)中加热时间为0.5-1h。

8.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述步骤(4)中氯仿与异戊醇的混合物中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。

9.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述步骤(5)中乙醇水溶液的质量分数为70%;乙醇水溶液的体积为上清液体积的1-2倍,离心的温度为4℃,离心速率为12000-16000g,离心时间为10min。

10.根据权利要求1所述的一种土壤微生物基因组的提取方法,其特征在于,所述步骤(5)中烘干的温度为70-100℃,烘干时间为20-30min。