1.一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征是:
A、牛皮明胶酶解
(1)加入碳酸氢铵溶液配制牛皮明胶溶液;
(2)加入胞内蛋白酶 Lys-C,使牛皮明胶酶解;
(3)再加入胰蛋白酶使牛皮明胶酶解;
B、同位素标记
(1)加酶:将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中;
(2)冻干;
(3)进一步去除水分;
(4)标记:一份牛皮明胶酶解物中加入H216O,另一份牛皮明胶酶解物中加入H218O,进行标记;
C、HPLC-LTQ Orbitrap MS检测
(1)将标记物和未标记物混合;
(2)上样检测:将混合样品注射进入HPLC-LTQ Orbitrap MS设备,检测牛皮明胶酶解物中H216O标记的特征峰和H218O标记的特征峰,上样量为0.5-20μg;
D、数据分析
(1)根据氨基酸序列,寻找牛皮明胶的特征峰;
(2)分析并记录特征峰在标记前后的峰面积;
(3)定量方法的准确性分析,即通过比较标记物/未标记物即18O/16O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性,18O/16O按照如下公式计算:其中,I0, I2 和 I4分别代表未标记即16O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰面积,质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积;M0, M2 和 M4分别代表未标记即16O的特征肽在理论上的单一同位素峰面积,质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积。
2.根据权利要求1所述的一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征是:所述牛皮明胶溶液的配比中加入10 mM的碳酸氢铵溶液溶解得到1 mg/ml的牛皮明胶溶液;
所述加入胞内蛋白酶酶解时,胞内蛋白酶与牛皮明胶质量比mg/mg 为1:100,酶解温度为37 ℃,反应时间为4 h;
所述再加入胰蛋白酶酶解时,胰蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg 为1:50,酶解温度为
37 ℃,反应时间为12 h。
3.根据权利要求1所述的一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征是:所述同位素标记中胰蛋白酶和牛皮明胶质量比为1:100-1:1;
所述冻干温度为-30至-80℃,冻干时间为2-24h;
所述进一步去除水分的条件是:加入20-200μl色谱乙腈,常温下真空干燥10-60min;
所述标记中H216O或H218O与牛皮明胶酶解物的质量比为10:1-100:1,标记所需温度为
10-60℃,时间为3-48h。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征在于:未标记时,胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为591.79742+-591.83742+,相应的氨基酸序列为EGPVGL*PGIDGR,其中*表示P被羟基化,经18O标记后,特征峰的质荷比变成593.79742+-593.83742+,氨基酸序列EGPVGL*PGIDGR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
5.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征在于:未标记时,
2+- 2
胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为634.3297 634.3697+,相应的氨基酸序列为GI*PGPVGAAGATGAR,其中*表示P被羟基化,经18O标记后,特征峰的质荷比变成636.32972+-636.36972+,氨基酸序列GI*PGPVGAAGATGAR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
6.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征在于:未标记时,胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为714.35762+-714.39762+,相应的氨基酸序列为GI*PGEFGL*PGPAGAR,其中*表示P被羟基化,经18O标记后,特征峰的质荷比变成716.35762+-716.39762+,氨基酸序列GI*PGEFGL*PGPAGAR中R的羧基末端两个16O
18
原子被 O代替。
7.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征在于:未标记时,胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为780.90102+-780.94102+,相应的氨基酸序列为GETGPAGPAGPIGPVGAR,经18O标记后,特征峰的质荷比变成782.90102+-782.94102+,氨基酸序列GETGPAGPAGPIGPVGAR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
8.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征在于:未标记时,胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为790.87712+-790.91712+,相应的氨基酸序列为GP*PGESGAAGPTGPIGSR,其中*表示P被羟基化,经18O标记后,特征峰的质荷比变成792.87712+-792.91712+,氨基酸序列GP*PGESGAAGPTGPIGSR中R的羧基末端两个16O原子被18O代替。
9.根据权利要求1、2或3所述的一种牛皮明胶的定量检测方法,其特征在于:未标记时,胞内蛋白酶 Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为923.44312+-923.48312+,相应的氨基酸序列为TG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK,其中*表示P被羟基化,经18O标记后,特征峰的质荷比变成925.44312+-925.48312+,氨基酸序列TG*P*PGPSGISGPPGP*PG*PAGK中K的羧基末端两个16O原子被18O代替。