1.一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定,形成连接探针1-捕获探针-金纳米粒子聚合物,即S1-CP-AuNPs聚合物,其中,连接探针1的核苷酸序列为5’-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3’,捕获探针的核苷酸序列为5'-SH-C6-AAA GGG TTG GGC GGG ATG GGT TGAGTC TTC C↓AG TGT GAT GAA ACC CAT C-3';
(2)石墨烯分散在壳聚糖溶液中,形成壳聚糖-石墨烯聚合物,即CS-GR复合物;
(3)在基底电极表面修饰CS-GR复合物,得壳聚糖-石墨烯/基底电极,即CS-GR/基底电极;
(4)将壳聚糖-石墨烯/基底电极处理后,浸在连接探针2中,得连接探针2/壳聚糖-石墨烯/基底电极,即S2/CS-GR/基底电极,其中,连接探针2的核苷酸序列为
5’-NH2-C6-TTT TTT TCT GAC GCT GCT CAC G-3’;
(5)将S2/CS-GR/基底电极浸在S1-CP-AuNPs聚合物中,通过S1和S2间碱基互补配对将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底电极上,制得连接探针1-捕获探针-金纳米粒子/连接探针2/壳聚糖-石墨烯/基底电极,即传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
2.根据权利要求1所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中,基底电极为玻碳电极。
3.根据权利要求1或2所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定,连接探针1和捕获探针中分别加入三(2-氯乙基)磷酸酯TCEP,室温避光处理1小时;将上述两溶液混合加入到金纳米粒子中,室温避光搅拌;搅拌的过程中逐滴加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl,再逐滴加入NaCl溶液,室温避光搅拌;将上述溶液离心,将沉淀重新分散在Tris-HCl和NaCl的混合溶液中,即得连接探针1-捕获探针-金纳米粒子聚合物,即S1-CP-AuNPs聚合物。
4.根据权利要求2所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中,玻碳电极用三氧化二铝粉打磨成镜面后清洗,晾干后,将CS-GR复合物滴涂在玻碳电极上,室温晾干,制得壳聚糖-石墨烯/玻碳电极,即CS-GR/GCE。
5.根据权利要求2所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(4)中,壳聚糖-石墨烯/玻碳电极浸在戊二醛溶液中,然后清洗;将清洗后的壳聚糖-石墨烯/玻碳电极浸在连接探针S2中,制得连接探针2/壳聚糖-石墨烯/玻碳电极,即S2/CS-GR/GCE。
6.根据权利要求4所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述清洗,是在二次水中清洗3~5分钟,然后依次在乙醇和二次水中超声3~5分钟。
7.根据权利要求5所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(4)中所述清洗,是分别在NaOH溶液和10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中。
8.权利要求1制备的一种多重信号放大的免标记电化学传感器。
9.权利要求8所述的免标记电化学传感器作为检测器在检测核酸中的应用,其特征在于,包括以下步骤:
(1)标准溶液配制:配制一组含有不同浓度p53基因的pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液为标准液;
(2)建立工作曲线:将所述传感器分别浸入标准溶液中40℃孵育80分钟,孵育后用Tris-HCl缓冲液冲洗,再将传感器分别浸入NEBuffer 3、氯高血红素、亚甲基蓝溶液中,每次浸入后均用Tris-HCl缓冲液冲洗,在10ml Tris-HCl、KCl和H2O2的混合溶液中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描,记录响应电流I,所述I值与标准溶液中p53基因浓度c的对数log c成正比,绘制I-log c标准曲线,或采用线性回归法得到I-log c线性回归方程;
(3)p53基因含量测定:将待测样品配制为含有步骤(1)相同浓度p53基因的Tris-HCl缓冲溶液,按照与步骤(2)相同的方法对所述传感器进行孵育和进一步反应后进行差分脉冲伏安扫描,记录响应电流I;根据响应电流I和I-log c线性回归方程,得到p53基因含量。
10.根据权利要求9所述的免标记电化学传感器作为检测器在检测核酸中的应用,其特征在于,步骤(1)中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为100mmol/L,步骤(2)中所用Tris-HCl的浓度均为10mmol/L,所述步骤(2)中NEBuffer 3含有0.5unit/μL N.BstNB I。