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专利号: 2015101277444
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种腈水解酶突变体,其特征在于所述突变体为下列之一:(1)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示;(2)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示;(3)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示;(4)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸,同时将第189位苯丙氨酸突变为半胱氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示;(5)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸,同时将第189位苯丙氨酸突变为丝氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示;(6)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸,同时将第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.14所示;(7)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸,同时将第189位苯丙氨酸突变为组氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示;(8)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为精氨酸,同时将第189位苯丙氨酸突变为赖氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.18所示;(9)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第132位苏氨酸突变为丙氨酸,同时将第189位苯丙氨酸突变为苏氨酸,氨基酸序列为SEQ ID NO.20所示。

2.一种由权利要求1所述腈水解酶突变体构建的重组载体。

3.一种由权利要求2所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述腈水解酶突变体在拆分邻氯扁桃酸制备(R)-邻氯扁桃酸中的应用。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述的应用为:以含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体为酶源,以外消旋邻氯扁桃酸为底物,以pH为7.5的Tris-HCl缓冲液为反应介质,以甲苯为助剂构成反应体系,在40℃、400rpm条件下反应,反应完全后,获得含(R)-邻氯扁桃酸的混合液,将混合液分离纯化,获得(R)-邻氯扁桃酸;所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为10g/L,所述助剂体积终浓度为10-30%,所述底物用量以反应体系总体积计为100-500mmol/L。

6.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述的应用为:将含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体用pH 7.5、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮制成菌悬液,以菌悬液为酶源,以外消旋邻氯扁桃酸为底物,于含体积终浓度5%甲醇、pH为4-9的pH缓冲液中构成反应体系,在30-75℃、200rpm条件下反应,反应结束后,获得含(R)-邻氯扁桃酸的混合液,将混合液分离纯化,获得(R)-邻氯扁桃酸;所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为1-5g/L,所述底物用量以反应体系总体积计为20mmol/L。

7.如权利要求5或6所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150rpm/min振荡培养到OD600=0.6~0.8;培养液以体积浓度2%接种量接种到新鲜的含有终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600=

0.6~0.8,加入终浓度0.5mM的IPTG,28℃、150rpm/min诱导培养10h,于4℃、9000rpm/min离心10min,收集湿菌体。