欢迎来到知嘟嘟! 联系电话:13095918853 卖家免费入驻,海量在线求购! 卖家免费入驻,海量在线求购!
知嘟嘟
我要发布
联系电话:13095918853
知嘟嘟经纪人
收藏
专利号: 2015101642753
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-10-11
缴费截止日期: 暂无
价格&联系人
年费信息
委托购买

摘要:

权利要求书:

1.一株产生用于不对称转化制备(S)-苯乙二醇的重组活性孢子的重组酿酒酵母,其分类命名为酿酒酵母(S. cerevisiae)AN120/pRS424-TEFpr-scrII,已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:CCTCC NO:M2015100。

2.利用权利要求1所述的重组酿酒酵母所产的重组活性孢子不对称转化制备(S)-苯乙二醇的方法,其特征是将(S)-羰基还原酶通过构建重组质粒pRS424-TEFpr-scrII转入酿酒酵母AN120中,得到重组酿酒酵母AN120/pRS424-TEFpr-scrII,利用培养得到含有目标酶的重组活性孢子,以2-羟基苯乙酮为底物,催化不对称转化反应:在1 mL 0.1 mol/L pH5.0~

5.5醋酸缓冲液,或1 mL 0.1 mol/L pH 6.0 7.5磷酸缓冲液,或1 mL 0.1 mol/L pH 8.0~ ~

9.0 Tris-HCl缓冲液中,重组活性孢子浓度为0.1 g/mL,2-羟基苯乙酮底物浓度为6 g/L,与2-羟基苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH,反应温度40℃,反应时间4 h。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于重组活性孢子的获得:

YPD液体培养基以g/L计:胰蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20,以去离子水配制;固体培养基添加15琼脂粉;

YPACE液体培养基以g/L计:KAc 20,胰蛋白胨20,酵母提取物10,以去离子水配制;

产孢培养基以g/L计:KAc 20,以去离子水配制;

培养条件:挑取重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/ pRS424-TEFpr-scrII的单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中,于30℃、200 rpm振荡培养16 h;取10 mL培养液转接于1 L的YPACE液体培养基中,于30℃、200 rpm振荡培养24 h后,6000 rpm、10 min无菌离心收集菌体,并转入1L产孢培养基中继续培养2 - 3 d,用显微镜镜检产孢效率,产孢完成后,6000 rpm、10 min离心收集菌体并以少量pH 6.0磷酸缓冲液重悬菌体,以超声细胞破碎仪处理1 h,工作强度50%、工作时间1 s、工作间隙3 s,离心收集重组活性孢子待用。

4.根据权利要求3所述的方法,其特征是重组酿酒酵母S. cerevisiae AN120/ pRS424-TEFpr-scrII的构建:YPD液体培养基以g/L计:胰蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20,以去离子水配制;

SD-Trp培养基以g/L计:葡萄糖20,氨基酸干粉混合物6.7,YNB 20,以去离子水配制;固体培养基添加20琼脂粉;

培养条件:挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中,30℃、200rpm震荡培养16 h,取1 mL菌液12000 rpm离心收集菌体,弃去上清,用100 μL 组成为1M DTT 10 μL、50% PEG 80 μL、2M LiAc 10 μL 的Buffer重悬菌体,加入重组质粒pRS424-TEFpr-scrII 1 μL,轻轻混匀后于45℃温浴30 min,取出后将菌液涂布SD-Trp平板,30℃倒置培养。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征是重组质粒pRS424-TEFpr-scrII的构建:

利用限制性内切酶Pst I 和Xho I,目的基因scrII与载体pRS424-TEFpr分别进行双酶切处理,处理后DNA片断通过粘性末端连接,获得重组质粒pRS424-TEFpr-scrII。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征是scrII基因的获得

以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板,利用含有Pst Ⅰ和Xho Ⅰ限制性酶切位点的引物SCR_F,SCR_R:SCR_F:5’-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’,SCR_R:5’-CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’;

PCR反应体系:ddH2O 37 μL,10×Reaction Buffer 5 μL,25 mmol/L dNTP 0.5 μL,50 pmol/μL的引物SCR_F和SCR_R各1 μL,基因组DNA 5 μL,5 U/μL的Taq DNA polymerase 0.5 μL;

PCR反应过程:94℃ 预变性5 min;94℃ 1 min、60 ℃ 30 s、72℃ 1 min,进行30个循环;72℃延伸10 min。

7.根据权利要求6所述的方法,其特征是用于获得scrII基因所需要提取的近平滑假丝酵母基因组的菌种为近平滑假丝酵母(C. parapsilosis) CCTCC NO:M203011。