1.一种赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）细胞膜悬液的制备：取血管内皮生长因子特异性受体高表达的、处于对数生长期的

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肿瘤细胞，采用含胎牛血清的培养基，于CO2培养箱内培养；当细胞计数达到10 ～10 时，应用胰蛋白酶将细胞消化，然后离心，取沉淀；将沉淀用生理盐水清洗后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超声破碎细胞，将悬液于1000 r/min、4℃条件下离心，取上清液于12000 r/min、4℃ 条件下离心20～25 min，得细胞膜沉淀，用生理盐水重悬，清洗后，加入生理盐水至膜蛋白含量为2.0～2.3 mg/mL，即为细胞膜悬液；

2）细胞膜固定相的制备：取预处理的大孔球形硅胶加入到低温反应管中，在振荡条件下，按照固液比1g：25～30 mL将细胞膜悬液加入到反应管中，吸附15～20 h，超声研磨

20～25 min后，于4000 r/min离心10～15 min，收集沉淀，用生理盐水洗涤2～3次，除去未结合的细胞膜，得细胞膜固定相；

3）赤魟软骨蛋白的制备与酶解：将破碎匀浆的赤魟软骨按固液比1 g：10～15 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提44～48 h后，于4 ℃、10000 r/min离心15～

20 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，用双蒸水于4 ℃以下透析22～24 h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；将赤魟软骨蛋白按固液比1 g :15～20 mL加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液中，按照赤魟软骨蛋白质量的1.5～2.5%加入中性蛋白酶（酶活力5

≥1.0×10 U/g），酶解温度55～65 ℃，酶解3～4 h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15 min，温度降至35～40 ℃，用NaOH调pH至7.5～8.0，按照赤魟软骨蛋白质量的1.5～2.5%加入胰蛋白酶，酶解温度为35～40 ℃，酶解3～4 h，将溶液升温至

90～95℃，并于此温度保持10～15 min，于10000 r/min、4℃ 条件下离心15～20 min，取上清液，上清液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，置于截留分子量为100的透析袋中，三蒸水透析24 h，冻干，得酶解物活性组分；

4）赤魟软骨多肽类血管生成抑制因子的制备：将酶解物活性组分用三蒸水配成

0.03～0.05 mg/mL的溶液，将细胞膜固定相按照固液比1 g:10mL加入到活性组分溶液中，

35～40℃保温孵育2～3 h后，4000 r/min离心10～15 min，留取上清液，沉淀用三蒸水淋洗8～10次，合并洗涤液和上清液，冻干，即为细胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC建立酶解物活性组分和细胞膜吸附剩余物的指纹图谱，纯化制备消失或峰面积显著减小的差异峰，并对其进行鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成抑制作用测定，活性最强峰经蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp，ESI-MS检测分子量为865.98 Da。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的肿瘤细胞为肝癌细胞Bel-7402。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的赤魟为 Sphyrna lewini。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中大孔球形硅胶的预处理方法为：将规格为5μm、 200Å的大孔球形硅胶中加入HCl溶液，超声处理15～20 min，转移至圆底烧瓶瓶中搅拌回流水解2～3 h后，将硅胶移至烧杯中，加双蒸水洗涤3～5次，每次25～30 min。

5.将洗涤处理好的大孔球形硅胶减压抽干，于120 ℃下活化6～8 h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤4）中的RP-HPLC条件为：进样量为5～10 μL；色谱柱是规格为250 mm × 4.6 mm，5 μm的Amethyst C18；洗脱条件为0～40 min内乙腈浓度由10%匀速升至50%；流速0.4 mL/min；紫外检测波长为215 nm。