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专利号: 2015102473485
申请人: 浙江大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-08-24
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.基于转录组序列开发的榨菜EST-SSR标记引物组,其特征在于,所述引物组包括1号引物~14号引物,所述1号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示;所述2号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示;所述3号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.6所示;所述4号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示;所述5号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.9所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.10所示;所述6号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.11所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.12所示;所述7号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.13所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.14所示;所述8号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.15所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.16所示;所述9号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.17所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.18所示;所述10号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.19所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.20所示;所述11号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.21所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.22所示;所述12号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.23所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.24所示;所述13号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.25所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.26所示;所述14号引物的正向引物的序列如SEQ ID NO.27所示,反向引物的序列如SEQ ID NO.28所示。

2.根据权利要求1所述的榨菜EST-SSR标记引物组,其特征在于,所述引物组通过以下步骤得到:

(1)获取榨菜转录组EST序列;

(2)采用SSRLocator软件对步骤(1)获得的EST序列进行SSR位点的筛选;

(3)榨菜EST-SSR引物的设计:依据上述步骤(2)筛选的EST-SSR位点,采用SSRLocator软件进行SSR引物设计出榨菜EST-SSR标记引物,得到引物组。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)具体为:

(1.1) 采集一个半月苗龄的榨菜幼嫩叶片,用锡箔纸包裹置于液氮中速冻后,转移到‐70℃冰箱内保存;

(1.2)使用Trizol 试剂提取榨菜的总RNA;提取样品总RNA后,用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA;利用mRNA反转录并合成双链cDNA,纯化cDNA,在cDNA末端添加腺嘌呤核苷并连接测序接头,然后通过琼脂糖凝胶电泳回收200-700 bp片段,将回收得到的片段进行TMPCR 扩增,建立测序文库,用Illumina HiSeq 2000 对测序文库进行测序;根据测序结果,从中选取已知方向的EST序列。

4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)具体为:先对上述步骤(1)中得到的序列进行聚类去冗余,然后进行SSR位点的筛选;筛选标准包括:单核苷酸的重复次数大于或等于16次,二核苷酸重复次数大于或等于6次,三核苷酸重复次数大于或等于

5次,四核苷酸重复次数和五核苷酸重复次数均大于或等于4次,六核苷酸重复次数~十核苷酸重复次数均大于或等于3次;同时也筛选中间被少数碱基(间隔小于或等于5 bp)打断的不完全重复的SSR位点。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中引物设计参数包括:引物长度为17-24bp;GC含量为30%-70%;退火温度为50-70℃;预期产物长度为100-280bp。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述引物长度最佳为20bp,GC含量最佳为50%;退火温度最佳为55℃,预期产物长度最佳为200bp。