1.一种生产低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)摇瓶发酵培养菌体,(2)收集菌体,氯仿/甲醇/水混合相体系提取分离单磷酸五条脂肪酸链的减毒Kdo2-类脂,(3)DEAE纤维柱纯化单磷酸五条脂肪酸链的减毒Kdo2-单磷酸类脂A;步骤(1)采用基因工程菌进行发酵培养,所述基因工程菌的基因型为E.coli W3110△waaCF△lacI△lpxMlacZ::FnlpxE;所述低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A化学式为C96H175N2O35P,其结构包含2个α-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸、2个氨基葡萄糖、1个磷酸基团和5条脂肪酸链,是以β-(1’-6)连接的D-葡萄糖胺二糖为骨架,6’位连接二α-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸,4’位被磷酸化,2’位氨基连接(R)-3-(十二烷氧基)十四烷基,3’位、3位和2位氨基分别连接十四烷氧基而构成,其结构式如式1所示;
所述基因工程菌的构建包括如下步骤:1)将人工构建的lacI敲除片段转化入E.coli W3110/pKD46感受态细胞中,获得突变株E.coli W3110lacI::Pkan,通过Cre酶介导的loxP位点特异性重组去除卡那霉素抗性基因;2)FnlpxE片段电转入步骤1)制备的E.coli W3110 △lacI/pKD46感受态细胞中,获得重组菌,其基因型为E.coli W3110△lacIlacZ::FnlpxE-Fkan,通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因,构建成中间菌株HW001;3)在HW001突变株的基础上转入人工构建的lpxM敲除片段转化入HW001/pKD46感受态细胞中,获得重组菌E.coli W3110△lacIlacZ::FnlpxE lpxM::Pkan,再次通过Cre酶介导的loxP位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因,构建成中间菌株HW002;4)在HW002突变株的基础上将人工构建的waaCF敲除片段转化入HW002/pKD46感受态细胞中,获得重组菌E.coli HW002waaCF:Pkan,再次通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因,最终基因型为E.coli W3110△waaCF△lpxM△lacIlacZ::FnlpxE,构建成基因工程菌株BW002;lacI敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;构建的FnlpxE-Fkan插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;构建的lpxM敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;构建的waaCF敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;
所述步骤(3)的DEAE纤维柱纯化是用6倍体积的体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/水平衡DEAE吸附柱;用一倍体积的体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/水溶液洗出Kdo2-类脂A粗样,上样到柱子中;待样品流至填料上端时,用体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/醋酸铵溶液进行阶段洗脱,其中水相醋酸铵的浓度梯度分别取60mM、120mM、240mM、360mM、480mM;收集洗脱液并添加适量的氯仿和水,使洗脱液变成Bligh-Dyer二相体系,静置30mins,取下相,氮吹。
2.权利要求1所述方法在制备疫苗佐剂中的应用。