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专利号: 2015103993650
申请人: 浙江海洋学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-03-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:

1)虾仁加工下脚料蛋白酶解物的制备:将虾仁加工下脚料用组织捣碎机粉碎,按照料液比1g:4~5mL加入磷酸盐缓冲液,于45~50℃下于超声功率400~500W下超声60~90min,然后加入中性蛋白酶,于45~50℃保温2~3h后,温度升至90~95℃并保持10~15min;溶液温度降至37~40℃,pH调至7.5~8.0,加入胰蛋白酶,保温2~3h后,温度升至90~95℃并保持10~15min后,于9000~10000g离心15~20min,得上清液,即虾仁加工下脚料蛋白酶解物;所述的虾仁加工下脚料含有虾头或虾壳;所述的磷酸盐缓冲液为0.2mol/L,pH6.5~

7.5;

2)虾仁加工下脚料锌螯合肽的制备:将制备的蛋白酶解物采用3kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3kDa部分,得超滤酶解液,超滤酶解液按照体积比加入到装有8~10倍NKA-9大孔树脂的层析柱中,用2~3倍柱体积水洗脱除去杂质,然后用3~5倍柱体积的30%和60%乙醇进行洗脱,收集60%乙醇洗脱液,于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物,多肽混合物依次经固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化制备氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met、ESI/MS检测分子量为

1027.20Da的虾仁加工下脚料锌螯合肽;

所述的反相高效液相色谱纯化制备具有如下步骤:

①固定化锌离子层析柱层析:将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10~20mg/mL的溶液,以0.5~1.5mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱,分别用3~5柱体积的水和0.1mol/L NaCl洗脱,收集0.1mol/L NaCl洗脱组分,即为亲和层析组分;

②凝胶柱层析:将亲和层析组分溶于双蒸水配成浓度为10~20mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据214nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物;

③RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45~55μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化;

所述RP-HPLC条件为:进样量8~10μL;色谱柱为Zorbax C18;流动相:15%乙腈;洗脱速度0.5~0.8mL/min;紫外检测波长220nm;

根据对Zn的螯合活性得1个高Zn螯合活性胶原肽;

④结构检测:Zn螯合胶原肽经检测为单一峰,利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met,ESI/MS检测分子量为1027.20Da。