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专利号: 2015103993805
申请人: 浙江海洋学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-08-26
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备方法,其特征在于包括下述步骤:

1)蟹壳下脚料预处理:取过100目筛的蟹壳下脚料,按照料液比1g: 5 ~10mL加入异丙醇,于40~50℃脱脂8~10 h,然后于8000~10000 rpm离心10~15 min除去异丙醇,收集脱脂蟹壳下脚料固形物;

2)蟹壳下脚料的酶解:将上述脱脂蟹壳下脚料固形物按固液比1g:10~15mL加入磷酸盐缓冲液,混合液温度升至45~50℃、超声处理10~15 min;然后按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的1.0~1.5%加入中性蛋白酶,在45~50℃酶解4~6 h;将酶解液升温至90~95℃后恒温保持10~15 min,酶解液温度降至50~60℃,按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的2.0~2.5%加入木瓜蛋白酶,在50~60℃酶解4~6 h,冷却至室温,于9000~10000 rpm离心10~15min,除去沉淀物,得到酶解液;步骤2)磷酸盐缓冲液为0.05 mol/L,pH 6.5~7.5;

3)蟹壳下脚料抗氧化肽链的制备:将步骤2)制备得到的上述酶解液采用1 kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于1 kDa部分,得到超滤酶解液;将超滤酶解液按照体积比加入到装有6~8倍DA201-C大孔树脂的层析柱中,用4~5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质,然后用5~8倍柱体积的70%乙醇进行洗脱,乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物,多肽混合物依次经阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化,得到蟹壳下脚料抗氧化肽链。

2.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤1)中的蟹壳,其来源为三疣梭子蟹。

3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述步骤3)的阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为:

离子交换树脂层析:将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50 mg/mL的溶液,经过DEAE Sepharose FF阴离子交换树脂层析柱分离,用水、0.25~0.35 mol/L和0.45~0.55 mol/L NaCl溶液进行洗脱,根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,对羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物;

凝胶柱层析:将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15~20 mg/mL的溶液,经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离,用双蒸水进行洗脱,根据215 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分,其中,具有最高羟基自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物;

RP-HPLC纯化:将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100 μg/mL的溶液,利用RP-HPLC进行纯化,根据对羟基自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp。

4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于所述步骤3)中的RP-HPLC条件为进样量8~10 μL;色谱柱为规格250 mm×4.6 mm,5 μm的 Hypersil BDS C18;流动相为含0.1%三氟乙酸的25%乙腈;洗脱速度为0.5~0.8 mL/min;紫外检测波长215 nm。