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专利号: 2015104898526
申请人: 华南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种荔枝炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)LAMP引物,其特征在于包括内引物对F3和B3,以及外引物对FIP和BIP,序列如下所示:F3:5’-GCTGGGCTTCTGGTTATTGC-3’

B3:5’-GCCAACCGGCAAAAAGGATG-3’

FIP:5’-ATCAGCCAGGTGGGGTGGG-GCTGCTGGCTGACAGGA-3’BIP:5’-GCCTCCAGCTGCAGGGTTCAA-GCGGACAAAGACGCCTCTA-3’。

2.一种基于权利要求1所述的荔枝炭疽菌LAMP引物的快速检测方法,其特征在于包括以下步骤:以待检测样本的DNA为模板,利用所述荔枝炭疽菌LAMP引物进行

LAMP反应扩增,再通过荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

3.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:25μL,其中F3与B3各0.2μM,FIP与BIP各1.6μM,20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2~4mM MgSO4,0.1%Tween-20,0~1.2MBetaine,1mM dNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段,10~50ng DNA模板,不足部分用无菌双蒸水补足;LAMP反应条件为在60~65℃温育30~90min,80℃保温5~10min。

4.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:25μL,其中F3与B3各0.2μM,FIP与BIP各1.6μM,20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,4mM MgSO4,

0.1%Tween-20,0.2M Betaine,1mM dNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段,25ng DNA模板,不足部分用无菌双蒸水补足;LAMP反应条件为在64℃温育80min,80℃保温10min。

5.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述荧光染料目测观察法:在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μL显色剂,所述显色剂为SYBR GreenⅠ,观察结果进行判断,显色结果观察到绿色荧光判断为阳性,橙色判断为阴性。

6.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述琼脂糖凝胶电泳法:取6μL LAMP反应的最终扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,观察结果,出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性,没有出现扩增条带判断为阴性。

7.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述待检测样本的DNA通过DNA抽提试剂盒法提取。

8.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:当所述的待检测样本为菌体时,使用真菌DNA抽提试剂盒法提取。

9.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:当所述的待检测样本为植物组织时,使用植物组织DNA抽提试剂盒法提取。

10.根据权利要求2~9任一项所述的快速检测方法在荔枝炭疽菌的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。