1.一种荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii)LAMP引物,其特征在于包括内引物对F3和B3,以及外引物对FIP和BIP,序列如下所示:F3:5’-TGAGGACGTGTACTCGTTCC-3’;
B3:5’-CGCTCATACAGTGGGTGATC-3’;
FIP:
5’-AGCTAAACTGTGACCAGGGTGGCGTCTCCTTTTGGCTTCGTG-3’;
BIP:
5’-GTTACCCGGTCAGCTATGCTGGGCGGGCTTTGAACATCTTGT-3’。
2.一种基于权利要求1所述的荔枝霜疫霉菌LAMP引物的快速检测方法,其特征在于包括以下步骤:以待检测样本的DNA为模板,利用所述的荔枝霜疫霉菌LAMP引物进行LAMP反应扩增,再通过荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行检测。
3.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:25μL,其中F3与B3浓度分别为0.2μM,FIP与BIP浓度分别为1.6μM,20mM Tris-HCl,
10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2~4mM MgSO4,0.1%Tween-20,0~1.2M Betaine,1mM dNTPs,
8U Bst DNA聚合酶大片段,10~50ng DNA模板,不足部分用无菌双蒸水补足;反应条件为在60~65℃温育30~90min,80℃保温5~10min。
4.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:所述LAMP反应体系为:25μL,其中F3与B3浓度分别为0.2μM,FIP与BIP浓度分别为
1.6μM,20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2~4mM MgSO4,0.1%Tween-20,0~1.2M Betaine,1mM dNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段,25ng DNA模板,不足部分用无菌双蒸水补足;反应条件为在65℃温育60min,80℃保温10min。
5.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:所述LAMP反应体系为:25μL,其中F3与B3浓度分别为0.2μM,FIP与BIP浓度分别为1.6μM,
20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2mM MgSO4,0.1%Tween-20,0.2M Betaine,1mM dNTPs,8U Bst DNA聚合酶大片段,25ng DNA模板,不足部分用无菌双蒸水补足;反应条件为在65℃温育60min,80℃保温10min。
6.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:所述荧光染料目测观察法:在LAMP反应的最终扩增产物中加入1μL显色剂,所述显色剂为SYBR GreenⅠ,观察显示结果,显色结果观察到绿色荧光判断为阳性,橙色判断为阴性。
7.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:所述的琼脂糖凝胶电泳法:取6μL LAMP反应的最终扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,观察结果,出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性,没有出现扩增条带判断为阴性。
8.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:所述待检测样本的DNA通过DNA抽提试剂盒法提取。
9.根据权利要求2所述的快速检测方法,其特征在于:所述LAMP反应体系为:当所述的待检测样本为菌体时,使用真菌DNA抽提试剂盒法提取;当所述的待检测样本为植物组织时,使用植物组织DNA抽提试剂盒法提取。
10.根据权利要求2~9任一项所述的快速检测方法在荔枝霜疫霉菌的早期诊断、病菌的监测和鉴定中的应用。