1.一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒,其特征在于:由原代培养肝脏细胞、DMEM完全培养基、底物缓冲液、氧化型辅酶Ⅰ溶液和2,4-二硝基苯肼溶液构成。
2.根据权利要求1所述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒,其特征在于:所述的原代培养肝脏细胞的制备方法是:
1)将动物肝脏组织放入平皿,采用灌流法,控制蠕动泵流速为0.9-1.7mL/min,灌入D-Hanks缓冲液冲洗血细胞,然后以同样流速灌流消化液10-20min;
2)将冲洗后的肝脏组织转移到新的平皿中,用细胞刷轻轻将细胞刮下,加入磷酸盐缓冲液,重悬细胞,过200目筛网,300r/min离心4min,弃上清液;
3)加入4℃预冷的DMEM完全培养基重悬沉淀,300r/min离心4min,弃上清液,再次重悬沉淀,500r/min离心4min,弃上清液,得原代培养肝脏细胞。
3.根据权利要求2所述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒,其特征在于:所述的D-Hanks缓冲液是:取0.08g KCl,0.012g KH2PO4,1.6g NaCl,0.07g NaHCO3,0.027g NaHPO4·12H2O,0.2g D-葡萄糖,0.02g的EDTA或不加EDTA,溶于200mL蒸馏水中,115℃灭菌10min。
4.根据权利要求2所述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒,其特征在于:所述的消化液是:0.08g/LⅣ型胶原酶水溶液或10g/L聚乙烯吡咯烷酮水溶液。
5.根据权利要求1或2所述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒,其特征在于:所述的DMEM完全培养基是:于500mL的DMEM培养基中,加入体积百分比为20%的胎牛血-6清,青霉素100μg/mL,链霉素100μg/mL,胰岛素5μg/mL,氢化可的松10 mol/L,转铁蛋白
5μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒,其特征在于:所述的底物缓冲液是:pH为8.8的0.3mol/L的乳酸锂水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒,其特征在于:所述的氧化型辅酶Ⅰ溶液是:浓度为5mmoL/L的氧化型辅酶Ⅰ水溶液。
8.根据权利要求1所述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒,其特征在于:所述的2,4-二硝基苯肼溶液是:浓度为1mmoL/L的2,4-二硝基苯肼水溶液。
9.权利要求1-8任一所述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒在筛选治疗肝脏疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于方法如下:
1)将原代培养肝脏细胞,于DMEM完全培养基中,细胞贴壁24h后,换液时,实验组,加入含有待测药物的DMEM完全培养基,继续培养48h;
对照组,加入不加药物的DMEM完全培养基,继续培养48h;
2)实验组与对照组收集细胞,分别离心取上清液;
3)取实验组与对照组离心后上清液,分别加入底物缓冲液,37℃水浴加热5min;
4)实验组加入氧化型辅酶Ⅰ溶液,对照组加入双蒸水,37℃水浴加热15min;
5)实验组与对照组,均加入2,4-二硝基苯肼溶液,37℃水浴加热15min;
6)实验组与对照组,均加入NaOH溶液,混匀,室温放置5min,于440nm处测量吸光度值。