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专利号: 2015106625932
申请人: 湖北工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法,其特征在于包括如下步骤:

(1)基因工程菌细胞膜的透膜处理

将经诱导表达后的用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌先后用正己烷和二甲苯进行透化处理,离心收集透膜处理的菌体,用磷酸盐缓冲液洗涤后备用;其中,用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌为敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的大肠杆菌;

所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶AtcC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;

(2)固定化细胞的制备

通过海藻酸钙包埋法将步骤(1)所获得的经透膜处理的基因工程菌固定得到固定化细胞;

(3)固定化细胞转化DL-ATC生成L-半胱氨酸

将步骤(2)得到的固定化细胞加入到含有DL-ATC、KH2PO4、山梨醇的体系中进行反应得到L-半胱氨酸。

2.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法,其特征在于:

步骤(1)中所述的大肠杆菌为染色体上整合有受λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的大肠杆菌;所述的半胱氨酸脱巯基酶基因为tnaA和malY基因。

3.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法,其特征在于:编码步骤(1)中所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,编码步骤(1)中所述的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法,其特征在于:步骤(1)中所述的用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌通过包括如下步骤的方法构建得到:a.将序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段通过NdeI、EcoRI连接到pET-28a(+)载体上构建得到ATC消旋酶表达载体;

b.将序列如SEQ ID NO.6所示的DNA片段通过EcoRI、NcoI连接到pACYC184载体上构建得到L-ATC水解酶和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶表达载体;

c.将上述两种表达载体共同转入敲除半胱氨酸脱巯基酶基因的大肠杆菌中,即得到用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌。

5.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法,其特征在于:步骤(1)中所述的基因工程菌的干重与正己烷的体积比为1mg:5-40μL,基因工程菌的干重与二甲苯的体积比为1mg:10-50μL;所述的透膜处理的条件为30℃透化透膜5-40min。

6.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法,其特征在于:步骤(2)为:将所获得的经透膜处理的基因工程菌加入到15g/L的海藻酸钠溶液中混合均匀,使得菌体浓度为5-20mg/mL,将混合液滴入到20g/L的氯化钙溶液中得到固定化细胞凝胶珠;

再将固定化细胞凝胶珠放置在20g/L的氯化钙溶液中,4℃过夜;固定化细胞再用无菌水洗涤后,置于4℃备用。

7.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法,其特征在于:

步骤(3)中的反应体系为:固定化细胞浓度为50-300g/L,DL-ATC浓度为5-20g/L,KH2PO4浓度为0.5-2g/L,山梨醇浓度为10-200g/L,pH为6-8;步骤(3)中所述的反应的条件为:反应温度为28-37℃,搅拌转速为100-200转/分钟,反应时间为2-6h。

8.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法,其特征在于:步骤(3)反应完成后通过过滤回收固定化细胞,再用KH2PO4浓度为2g/L、山梨醇浓度为200g/L、pH为7.5的洗涤缓冲液洗涤固定化细胞后重复用于步骤(3)。

9.一种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌,其特征在于:为敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的大肠杆菌;所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶AtcC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

10.一种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的固定化细胞,其特征在于:通过海藻酸钙包埋法将权利要求9所述的基因工程菌固定得到。