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专利号: 2015107726748
申请人: 浙江理工大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 有机化学〔2〕
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种利用特征六肽制备柞蚕丝素蛋白抗体的方法,其特征是,包括以下步骤:步骤一:利用Fmoc法合成序列为“CGSGAGG”的多肽,并通过所诉多肽的N端的半胱氨酸使该多肽与匙孔血蓝蛋白偶联得到完全抗原;

步骤二:用生理盐水稀释所述完全抗原,将稀释后的完全抗原与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂均匀混合,得到初次免疫所用的试剂;

选取2只大白兔进行初次免疫和加强免疫,免疫前抽取兔耳血样做对照;

首先对兔子进行初次免疫,然后对兔子进行加强免疫,加强免疫使用的试剂与初次免疫一致;当兔子血样中的抗体的效价达到1:10000时,收集免疫后的兔子血液,并使血块充分收缩及抗血清完全析出,然后收集抗血清并离心处理得到上清液,分装备用;

步骤三:利用免疫亲和层析技术对抗血清进行纯化;先将合成的半抗原(即多肽“GSGAGG”)和层析填料交联剂Sulfo-link-gel进行交联,使“GSGAGG”N端的甘氨酸封闭;

用20ml、50mM、pH7.4的PBS对柱进行预处理,预处理的流速为60ml/h;

用50mM、pH7.4的PBS将15ml的抗血清稀释至20ml,稀释后上样,重复上样一次;

用30ml、50mM、pH7.4的PBS对柱进行清洗,清洗的流速为60ml/h;用pH3.0、0.1M的甘氨酸盐酸glycine-HCL对抗体进行洗脱;洗脱完成后用含50mM、pH7.4、含0.02%硫柳汞钠的PBS洗涤多肽柱,得到纯化后的抗体调节pH至7.4并于4℃储存;

步骤四:抗体特异性效果测定:抗原丝素蛋白以1μg/ml的浓度包被,4℃包被过夜;将抗体分别稀释240000倍、60000倍、20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍,50μl/孔的量上样,37℃下温育1h;用TBST以200μl/孔洗涤2遍;酶标二抗以1:5000稀释使用,50μl/孔、37℃下温育1h。用TBST以200μl/孔洗涤3遍;以100μl/孔加入TMB于阴暗处显色,显色10min后,以

100μl/孔加入2M的H2SO4终止;

步骤五:用酶标仪测定OD450值;

当OD450值>0.6,则证明所检测的样品呈现阳性,说明样品中含有丝素蛋白;

当OD450值≤0.6,则证明所测得的样品呈现阴性,说明样品中不含有丝素蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征是:在所述步骤二中,用生理盐水将完全抗原稀释到2倍最终浓度。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征是:在所述步骤二中,在配制初次和加强免疫试剂时,稀释后的完全抗原与佐剂是按体积比1:1进行混合。

4.根据权利要求1所述的方法,其特征是:在所述步骤二中,对兔子进行初次免疫的方法是:通过后腿小腿肌肉注射免疫兔子,每只兔子注射100μl;对兔子进行加强免疫的方法是:在初次免疫的第21天按同样方式加强免疫一针。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征是:在所述步骤二中,收集抗血清后处理的方法是:在温度为4℃于3000g条件下离心15min,分装上清液,放置于-80℃储存备用。