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专利号: 2015108043866
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2023-12-11
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种环二肽类化合物的制备方法,其特征在于所述方法是将桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101接种在含钴离子的发酵培养基中,在25~30℃、200~250r/min恒温振荡条件下培养5~7d后,再在25~30℃下静置4~5d,培养液经分离纯化,获得环二肽类化合物;所述发酵培养基组成为:葡萄糖10~20g/L,蛋白胨2~5g/L,酵母浸膏1~2g/L,溶剂为体积比1:1~2的人工海水与蒸馏水混合液,pH6~7;所述每升人工海水组成为:NaCl 

24.48g,Na2SO43.917g,KCl 0.664g,KBr 0.096g,SrCl20.024g,MgCl·6H2O 4.981g,CaCl2·H2O 1.102g,NaHCO30.192g,H3BO30.026g,NaF 0.004g,用蒸馏水定容至1L。

2.如权利要求1所述环二肽类化合物的制备方法,其特征在于所述钴离子以氯化钴的形式加入,所述氯化钴在发酵培养基中的终浓度为1~2g/L。

3.如权利要求1所述环二肽类化合物的制备方法,其特征在于所述发酵培养基组成为:

葡萄糖20g/L,蛋白胨5g/L,酵母浸膏2g/L,溶剂为体积比1:1.5的人工海水与蒸馏水混合液,pH7.0。

4.如权利要求1所述环二肽类化合物的制备方法,其特征在于所述桔青霉MNP12010101在发酵培养前先进行斜面培养和种子培养:(1)斜面培养:将桔青霉MNP12010101接种至斜面培养基,于25~30℃培养48~60h,获得斜面菌种孢子;所述的斜面培养基组成为:马铃薯150~250g/L,葡萄糖15~30g/L,琼脂

18~20g/L,溶剂为人工海水,pH自然;所述人工海水组成同发酵培养基;

(2)种子培养:将桔青霉MNP12010101经斜面活化培养的菌种孢子接种于种子培养基中,于25~30℃、150~250r/min振荡条件下培养36~48h,得种子液;所述的种子培养基组成为:葡萄糖10~20g/L,蛋白胨2~5g/L,酵母浸膏1~2g/L,溶剂为体积比1:1~2的人工海水与蒸馏水混合液,pH6~7;所述人工海水组成同发酵培养基。

5.如权利要求1所述环二肽类化合物的制备方法,其特征在于所述从培养液分离纯化获得环二肽类化合物的方法为:

(1)将培养液过滤,滤液用乙酸乙酯萃取3~5遍,合并萃取液,于45℃减压蒸馏除去乙酸乙酯,所得膏状物即为发酵液提取物;滤饼用甲醇浸泡12~24h,再于25℃、100KHz超声提取30~60min,二次过滤除去菌体,二次滤液于50℃减压蒸馏除去甲醇和水分,所得二次膏状物用甲醇溶解,离心弃去沉淀,上清液再次于50℃减压蒸馏除去甲醇,反复1~3次,获得菌体提取物,合并发酵液提取物和菌体提取物,即为发酵总浸膏;

(2)将步骤(1)制备的发酵总浸膏用甲醇溶解后采用AB-8大孔吸附树脂进行分离,先用

2倍柱体积的纯水淋洗,再分别用2倍柱体积的体积浓度为20%、40%、60%的乙醇水溶液洗脱,分别收集流出液f1、流出液f2和流出液f3,减压浓缩至膏状,获得膏状物F1、膏状物F2和膏状物F3;

(3)将步骤(2)中膏状物F1用甲醇溶解后进行MCI层析分离,分别用2个柱体积的体积浓度10%和体积浓度20%的乙醇水溶液洗脱,分别收集流出液f4和流出液f5,流出液f4减压浓缩后获得的膏状物F4用甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化,以体积浓度11%的甲醇水溶液为流动相,收集主峰的流出液,蒸干溶剂后,即得环(甘-脯)二肽;流出液f5减压浓缩后获得的膏状物F5用甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化,以体积浓度19%的甲醇水溶液为流动相,收集2个主峰流出液,蒸干溶剂后,即得环(丙-脯)二肽和环(异亮-脯)二肽;

(4)将步骤(2)中膏状物F3用甲醇溶解后采用MCI层析柱分离,用体积浓度45%的乙醇水溶液洗脱,收集流出液f6浓缩后获得的膏状物F6用甲醇溶解再经ODS-C18柱纯化,以体积浓度47%的甲醇水溶液为流动相,收集主峰流出液,蒸干溶剂后,即得环(丙-缬)二肽。