1.同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法,其特征在于该方法包括以下步骤:步骤(1)、啤酒污染酵母菌DNA模板提取:
采用通用的DNA提取方法和纯化方法,从酿酒用高浓度酵母菌中取样品,或从酿酒过程中麦汁或发酵液中取样品,提取得DNA;
步骤(2)、多重PCR扩增:
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后,进行多重PCR扩增, 得到扩增产物;
所述的多重PCR扩增反应体系为20 μ l , 由100nM正向混合引物2 μ L ,100nM反向混合引物2 μ L ,25mM的MgCl2 4 μ L ,5×PCR Buffer 4 μ L ,5U/μ L 的Taq聚合酶0.7 μ L ,DNA模板1 μ l 和余量双蒸水;其中正向混合引物中SEQ ID NO.1引物、SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.5引物、SEQ ID NO.7引物的浓度比为1:1:1:1,反向混合引物中SEQ ID NO.2引物、SEQ ID NO.4引物、SEQ ID NO.6引物、SEQ ID NO.8引物的浓度比为1:1:1:1;
步骤(3)、毛细管电泳分离条件;
步骤(4)、检测鉴定:
将所述步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时,通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为142bp、147bp、335bp、
359bp相应位置处出现特征峰;若在142bp相应位置处出现特征峰,则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Pichia fermentans;若在147bp相应位置处出现特征峰,则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Candida mesenterica;若在335bp相应位置处出现特征峰,则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Hansenula polymorpha;若在359bp相应位置处出现特征峰,则判断为该检测样品中含有污染酵母菌Rhodotorula glutinis。
2.如权利要求1所述的同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法,其特征在于步骤(2)所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min;以94℃30s;58℃
30s;70℃1min为1个循环,共进行35个循环;4℃保温。
3.如权利要求1所述的同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法,其特征在于步骤(3)分离体系:1 μ L 所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95%去离子甲酰胺38.5 μ L ,400bp DNA Marker 0.5 μ L 混合均匀。
4.如权利要求1所述的同时鉴定啤酒酿制中四种污染酵母菌的基因快速筛查方法,其特征在于步骤(3)分离条件:在50℃、6.0KV电压下,分离35min。