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专利号: 2015108932687
申请人: 湖南师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-01-05
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种抗人PCT蛋白N端氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法,该方法包括如下步骤:(1)将人PCT蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化,采用皮下免疫方法,以每只小鼠免疫蛋白浓度分别为30 µg、50 µg、100 µg和150 µg四个梯度的剂量,每个梯度免疫3只6~8周龄BALB/c雌性小鼠;其中所述的人PCT蛋白由如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列所编码;

(2)两周后进行第2次免疫,将人PCT蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化,采用与步骤(1)中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠;

(3)2周后分别进行第3次免疫,免疫剂量与方法同第2次免疫;

(4)融合前3 d用不加佐剂的人PCT抗原,采用皮下加强免疫,每只剂量为100 μg;

(5)融合前1 d用不加佐剂的人PCT抗原加强免疫,每只剂量50 μg;

(6)小鼠眼角进行采血,4 ℃,4000 g离心5 min,取上清,间接ELISA法检测血清效价,选取血清效价大于1,000,000的小鼠准备进行细胞融合试验;

(7)选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以1:5~1:10混合,

1500 g离心5 min,收集细胞沉淀,弃上清;

(8)轻摇离心管使细胞均匀分散,缓缓加入1 mL 37 ℃预热的PEG 1500并轻轻混匀1.5 min,然后加入20 mL 1640培养基;

(9)800 g离心5 min,收集细胞沉淀,弃上清,细胞中加入含有20%血清的HAT-1640培养基并混匀;

(10)将混匀细胞均匀铺于96孔板中,在37 ℃,CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养5~7 d后观察融合效果并换液;

(11)换液后第4 d用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液,选择阳性值高且细胞集落数目少的孔,通过有限稀释法进行亚克隆,每孔细胞数目理论值为1~2个;

(12)经过3~4次亚克隆后,即获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株;

(13) 进一步筛选和鉴定能够分泌识别的表位位于PCT蛋白的N末端氨基酸,而不识别降钙素(CT)的氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.如权利要求1所述的制备方法获得的杂交瘤细胞株。

3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

4.一种分泌抗人PCT蛋白N端氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞,其是保藏编号为CCTCC NO:C2015155的杂交瘤细胞,保藏于中国典型培养物保藏中心。

5.如权利要求4所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

6.如权利要求3或5所述的单克隆抗体在制备PCT蛋白检测的试剂盒中的应用。

7.如权利要求7所术的应用,其中检测PCT蛋白的方法采用双抗夹心ELISA法。