1.一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)人表皮生长因子基因片段的获得:设计引物,在人表皮生长因子基因上游引入限制性内切酶酶切位点和酵母菌kex2酶切位点,在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR,并引入限制性内切酶酶切位点,PCR扩增出目的片段;
(2)人表皮生长因子定向多拷贝克隆:步骤(1)中扩增出的目的片段经限制性内切酶酶切、连接,得到目的基因的定向多拷贝克隆;
(3)人表皮生长因子定向多拷贝克隆的酵母表达:将步骤(2)得到的定向多拷贝克隆转化至毕赤酵母中培养,经酵母菌本身的kex2酶自剪切,获得重组的目的蛋白单体;
步骤(1)中人表皮生长因子基因上游引入的限制性内切酶酶切位点为EcoR I和Bg1 II;下游引入的限制性内切酶酶切位点为BamH I、Not I、Sal I;
所述步骤(1)中的引物为:
Oligo1:tagaattcagatctgagaaaagaaactctgactctgagtg;
Oligo2:aactctgactctgagtgtccattgtcccacgacggttactgtttgcac;
Oligo3:agcgtacttgtccaaagcttcgatgtacatacagacaccgtcgtgcaaacagtaaccgt;
Oligo4:ctttggacaagtacgcttgtaactgtgtcgttggttacatcggtgagagatgtcaatac;
Oligo5:tctcttctcccaccacttcaagtctctgtattgacatctctcac;
Oligo6:atgtcgacgcggccgcctaggatcctctcttctcccaccacttcaagt。
2.如权利要求1所述的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法,其特征在于所述步骤(1)为:将引物通过SOE法获得人表皮生长因子基因片段。
3.如权利要求1所述的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法,其特征在于所述步骤(2)为:将步骤(1)获得的目的片段经EcoR I和Sal I双酶切,与同样双酶切的质粒PUC57连接,构建的质粒记作PUC57-hEGF,PUC57-hEGF经Bgl II/ NotI双酶切后回收hEGF片段;同时经BamH I/ NotI,双酶切后回收PUC57-hEGF片段,将回收的目的片段经T4连接酶连接,连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中,筛选得到2拷贝人表皮生长因子串联基因;在此基础上,继续进行酶切、连接可分别得到3拷贝、4拷贝、5拷贝的人表皮生长因子串联基因。
4.如权利要求3所述的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法,其特征在于步骤(3)为:将步骤(2)获得的含有人表皮生长因子1-5串联基因的质粒分别经EcoR I/Not I双酶切,与同样双酶切的pPIC9K载体连接,经电转化至毕赤酵母GS115,筛选得到阳性重组子,然后进行诱导表达,获得重组的目的蛋白单体。