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专利号: 2015110111965
申请人: 浙江海洋学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2025-03-19
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)缢蛏预处理:将缢蛏除壳剥肉后,用清水把蛤肉洗净,经高速组织搅碎机匀浆后,用异丙醇浸泡缢蛏肉3~5h,过滤后滤渣用纯化水泡洗至无异丙醇异味,脱水得缢蛏肉渣,备用;

(2)酶解:将步骤(1)中的缢蛏肉渣加入中性蛋白酶进行酶解,酶解条件为:料液比1:3~

4,加酶量1500~2000U/g,pH 值6.5~7.5,酶解温度50~60℃,酶解时间9~12 h,酶解完成后用沸水浴灭活,预冷后离心,得上清液;

(3)超滤分离:将上清液经0.45μm滤膜抽滤后,用截留分子量为3 ku的超滤膜进行超滤,得到超滤液;

(4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化,得到二个活性组分,分别取样测定该二个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性,取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A;

(5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化,得到三个活性组分,分别取样测定该三个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性,取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B,组分B经纯度检测后,即得氨基酸序列为:Pro-Trp - Gly - Met - Phe(PTGMP)的血管紧张素转换酶抑制肽。

2.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(1)中,缢蛏与异丙醇的质量比为1:3~5。

3.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(2)中,酶解期间不断搅拌。

4.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(2)中,预冷至4~6℃。

5.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(2)中,离心工艺条件为:转速5000~10000rpm/min,离心时间10~30min。

6.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(4)中,快速蛋白纯化系统分离纯化的具体方法为:采用DEAE-SepharoseFF离子交换层析柱(填料粒径10 μm,10×300 mm),将凝胶装柱,Tris-Hcl平衡后(pH为7.4),将超滤液配制成200mg/ml的溶液,每次上样量为3mL,分别用Tris-Hcl(pH为7.4)、0.1mol/L、0.3mol/L、

0.5mol/L、0.8mol/L和1mol/L的NaCl溶液进行阶段洗脱,洗脱速度为2.2ml/min;检测波长

280nm;收集各峰。

7.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(5)中,高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用葡聚糖凝胶G-25层析柱(尺寸:

2.6×80cm;柱料:Sephadex G-25),将组分B配制成200mg/ml的溶液,上样量:2.0mL;流动相:超纯水;洗脱液流速:1.0 mL/min;检测波长:280nm;自动收集速度:4.0min/管;收集各峰。

8.根据权利要求1所述的一种缢蛏血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(5)中,组分B纯度检测方法为:采用ZORBAX SB-C18 分析型色谱柱(填料粒径:5μm,4.6×

150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA),流动相B为乙腈(含0.05%TFA),采用等度洗脱方式:80%A,20%B;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;自动进样,进样量:20μL;检测波长:280 nm。