1.一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)青蛤预处理:将青蛤除壳、剥肉后,用清水把蛤肉洗净,经高速组织搅碎机匀浆后用
0.1mol/L的NaOH浸泡3~5h,过滤后滤渣用纯化水泡洗至pH呈中性,脱水后得青蛤肉渣,备用;
(2)酶解:将步骤(1)中的青蛤肉渣加入胰蛋白酶进行酶解,酶解条件为:料液比1:2~3,加酶量1000~1200U/g,pH 值7.5~8.5,酶解温度45~50℃,酶解时间9~12 h,酶解完成后用沸水浴灭活,预冷后离心,得上清液;
(3)超滤分离:将上清液经0.45μm滤膜抽滤后,用截留分子量为3ku的超滤膜进行超滤,得超滤液;
(4)快速蛋白纯化系统分离纯化:将步骤(3)中的超滤液经快速蛋白纯化系统进行分离纯化,得到五个活性组分,分别取样测定该五个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性,取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分A;
(5)高效液相色谱系统分离纯化:将组分A经高效液相色谱系统(HPLC)分离纯化,得到七个活性组分,分别取样测定该七个活性组分的血管紧张素转换酶抑制活性,取血管紧张素转换酶抑制活性最高的组分记为组分B,组分B经纯度检测后,即得氨基酸序列为:Trp-Pro-Met-Gly- Phe(TPMGP)的血管紧张素转换酶抑制肽。
2.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(2)中,酶解期间不断搅拌。
3.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(2)中,预冷至4~6℃。
4.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(2)中,离心工艺条件为:转速5000~10000rpm/min,离心时间10~30min。
5.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(4)中,快速蛋白纯化系统进行分离纯化的具体方法为:采用Superose 12 10/300 GL琼脂糖凝胶柱(填料粒径10 μm,10×300 mm),超滤液稀释至0.1 g/mL,过0.22 µm滤膜后进样,进样量:500 µL;超纯水洗脱,流速:0.5 mL/min;检测波长:280 nm;自动收集:3.5 mL/管,收集各峰。
6.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(5)中,高效液相色谱系统分离纯化的具体方法为:采用 ZORBAX SB-C18制备型色谱柱 (填料粒径5μm,4.6×250 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA),流动相B为乙腈(含0.05%TFA),采用梯度洗脱方式:5min 20% B,30min 100% B;流速:1.5 mL/min;检测波长:214和
280 nm;柱温:25℃;自动进样,进样量:500 μL,收集各峰。
7.根据权利要求1所述的一种青蛤血管紧张素转换酶抑制肽制备方法,其特征在于,步骤(5)中,组分B纯度检测方法为:采用ZORBAX SB-C18 分析型色谱柱(填料粒径:5μm,4.6×
150 mm);流动相A为超纯水(含0.05%TFA),流动相B为乙腈(含0.05%TFA),采用梯度洗脱方式:5min 20% B,30min 100% B;流速:1.0 mL/min;柱温:25℃;自动进样,进样量:500 μL;
检测波长:214和280 nm。