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专利号: 2015110181900
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-02-26
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一株产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌,其特征在于,所述酿酒酵母工程菌过表达来源于Aspergillus flavus的丙酮酸羧化酶基因Afpyc、苹果酸脱氢酶基因Afmdh和苹果酸转运蛋白基因Afmae。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌,其特征在于,所述丙酮酸羧化酶基因的氨基酸序列与NCBI上accession numble:XM_002377040的基因编码的氨基酸序列一致;所述苹果酸脱氢酶基因的氨基酸序列与是NCBI上accession numble:XM_002378178的基因编码的氨基酸序列一致;所述苹果酸转运蛋白基因的氨基酸序列一致在NCBI上accession numble:XM_002376564的基因编码的氨基酸序列一致。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌,其特征在于,所述过表达Afpyc是以PY14载体进行游离表达;所述过表达Afmae和Afmdh,是将这两个基因连接到PY26载体上进行游离表达。

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌,其特征在于,所述Aspergillus flavus是Aspergillus flavus ATCC13697。

5.一种权利要求1所述酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,所述方法包括:

(1)PCR扩增或者化学合成核苷酸序列分别如XM_002377040、XM_002378178、XM_002376564所示的Afpyc片段、Afmdh片段、Afmae片段;

(2)将Afpyc片段连接到质粒PY14上得到重组质粒PY14/TEF-Afpyc,将Afmae片段和Afmdh片段先后连接到质粒PY26上得到重组质粒PY26/GPD-Afmae TEF-Afmdh;并验证;

(3)将上一步得到的两个重组质粒,转化到酿酒酵母宿主中,涂布Ura及Trp缺陷平板进行筛选;

(4)验证正确的重组菌,即为产L-苹果酸的酿酒酵母工程菌。

6.权利要求1所述酿酒酵母工程菌在发酵生产L-苹果酸方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用是将酿酒酵母工程菌活化后,于温度30℃、转速800rpm,通气量1.5vvm,调节pH至5.0以下进行发酵,发酵时间为84h。

8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述发酵使用的发酵培养基含有:葡萄糖100g/L,K2SO4 6.6g/L,KH2PO4 3g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,尿嘧啶、色氨酸终浓度20mg/L,尿素终浓度1g/L,生物素终浓度为1mg/L,CaCl2·2H2O终浓度为5mM,微量金属离子液1mL/L,维生素液1mL/L;所述微量金属离子液,按mg/L计,含有:EDTA 15,ZnSO4·7H2O

4.5,CoCl2·6H2O 0.3,MnCl2·4H2O 1,CuSO4·5H2O 0.3,CaCl2·2H2O 4.5,FeSO4·7H2O 3,NaMoO42·2H2O 0.4,H3BO3 1,KI 0.1;所述维生素液,按mg/L计,含有:生物素0.05,泛酸钙

1,烟酸1,肌醇25,盐酸硫胺素1,盐酸吡哆醇1,对氨基苯甲酸0.2。